Un cebador que consiste en la secuencia del SEQ ID NO: 22 o uno de sus complementos

Método para detectar y cuantificar el virus de la hepatitis C.

Campo de la invención

La invención está dirigida a métodos y reactivos para detectar y cuantificar el virus de la hepatitis C (HCV) en muestras biológicas y a kits para llevar a cabo los métodos.

Bibliografía

Las citas bibliográficas completas para los documentos referidos se pueden encontrar en la sección Bibliografía, inmediatamente antes de las reivindicaciones.

Antecedentes

El virus de la hepatitis C (HCV) es un virus con ARN de cadena sencilla, que contiene un genoma de aproximadamente 9.400 nucleótidos. Véase Clark (1997). El HCV ha sido identificado como el principal agente etiológico para la hepatitis no A, no B, post-transfusión en todo el mundo. Rosen & Gretch (1999). Aproximadamente el 85% de los individuos infectados por HCV desarrollan hepatitis crónica, desarrollando aproximadamente el 20% de los individuos infectados crónicamente cirrosis. Véase Rosen & Gretch (1999). En pacientes con cirrosis, la incidencia de carcinoma hepatocelular es de aproximadamente 1% a 4% por año. Véase Consensus Statement (1999).

Se han desarrollado ensayos serológicos para la detección de anticuerpos anti-HCV. Véase Clark (1997). No obstante, la presencia de anti-HCV no es un indicador directo de viremia por HCV, puesto que no se pueden diferenciar las infecciones resueltas de las infecciones activas. Se ha utilizado la actividad alanina aminotransferasa (ALT) en suero como indicador sustituto de la infección activa por HCV, pero la actividad ALT tampoco proporciona una medida directa de la viremia por HCV. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.279.944.

Los ensayos de ácidos nucleicos para detectar y cuantificar el ARN de HCV proporcionan una medida directa de la viremia por HCV, y se han vuelto cada vez más importantes para mejorar la seguridad de la sangre, y para controlar a los pacientes en terapia. El ensayo cualitativo para HCV ha sido decisivo en la reducción del número de casos de infección por HCV post-transfusión. Es típico de estos ensayos cualitativos el Análisis HCV-RT-PCR de marca UltraQual producido por el National Genetics Institute (Los Ángeles, California). Este ensayo ha sido aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de los EEUU para el ensayo cualitativo de plasma reunido en busca de la presencia de HCV. Véase también la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.527.669, expedida el 18 de Junio de 1996.

De un modo similar, los ensayos cuantitativos para el ARN de HCV han sido decisivos en la comprensión de la eficacia de la respuesta anti-viral a tratamientos tales como la monoterapia con interferón y la terapia combinada con interferón/ribavirina. Véanse McHutchison et al. (1998) y Davis et al. (1998). El ensayo de la carga viral de HCV tiene implicaciones antes, durante, y después de la administración de la terapia anti-viral. Los niveles bajos de viremia en una medición en la linea base tomada antes del tratamiento se corresponden significativamente con una mayor respuesta a la terapia con interferón, conduciendo de ese modo al uso de una carga viral de HCV para pronosticar la respuesta individual del paciente a semejante terapia. Véanse Izopet et al. (1998); Kakumu et al. (1997); y Toyoda et al. (1996). La terapia de control con el ensayo de la carga viral de HCV puede permitir a los médicos diferenciar entre los pacientes que responden al tratamiento de aquellos que no, determinar la duración del tratamiento, y ajustar la terapia a los pacientes individuales. Véanse Izopet et al. (1998); Kakumu et al. (1997); Yamakawa et al. (1998); y Tong et al. (1997). Tras la terminación de la terapia, se han utilizado los niveles de ARN de HCV para pronosticar la recaída y para identificar a los pacientes que responden a largo plazo. Pawlotsky et al. (1996) y Chemello et al. (1996).

Compendio de la invención

La presente invención proporciona métodos, reactivos, y kits mejorados para cuantificar el virus de la hepatitis C (HCV) en muestras biológicas. El método utiliza cualquier método adecuado de amplificación de ácido nucleico, y utiliza preferiblemente la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), junto con el marcaje diferencial y la captura de los amplicones resultantes, para medir cuantitativamente la cantidad de ARN de HCV en una muestra biológica. El método utiliza un transcrito de ARN de HCV de control interno que es co-amplificado junto con cualquier ARN de HCV encontrado en la muestra. El control interno y cualquier ARN de HCV presente en la muestra son co-amplificados de una manera competitiva. De este modo, comparando la cantidad de control interno que es amplificado con la cantidad de ARN de HCV que es amplificado, se puede calcular la cantidad de ARN de HCV presente en una muestra de ensayo exactamente y precisamente. Asimismo, debido a que el método cuenta con un control interno para la calibración, se puede pre-fabricar una curva de calibración y enviar con el kit de análisis, limitando de ese modo el número de experimentos de calibración que el usuario debe realizar.

El método preferido continúa generalmente como sigue: primero se extrae el ARN de un espécimen biológico mediante cualquier medio conocido en la técnica o desarrollado en el futuro. En la realización preferida, se extrae el ARN utilizando un kit disponible en el mercado, el "Kit de Extracción de Ácido Nucleico Viral de marca QI amp" (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Véase "QI amp7Viral RNA Mini Kit Handbook", Enero de 1999. El virión es lisado con un caotropo, tal como isotiocianato de guanidinio (GuSCN), preferiblemente en presencia de proteinasa K, liberando de ese modo simultáneamente el ARN viral y protegiéndolo de la degradación por las ARNasas que pueden estar presentes en la muestra.

En el mismo momento en el que se añade el caotropo a la muestra, también se añade una cantidad conocida de un transcrito de ARN de HCV de control interno a la muestra. El control interno tiene una secuencia idéntica a la del ARN de HCV, con la excepción de una región de unión a la sonda modificada que permite una detección diferencial del control interno. Debido a que el control interno es idéntico al ARN de HCV (con la excepción de la única región de unión a la sonda), el control interno tiene los mismos sitios de unión al cebador que el ARN de HCV de tipo salvaje.

El ARN (esto es, tanto cualquier ARN de HCV presente en la muestra como el control interno) se hace precipitar después preferiblemente mediante un método adecuado conocido ahora o desarrollado en el futuro (por ejemplo la adición de etanol). Después el ARN es adherido a una membrana, tal como una membrana de sílice. El ARN adherido se lava después para separar los componentes distintos del ARN. De este modo, por ejemplo, el ARN adherido a la membrana se puede lavar con una elevada concentración de sal, seguido de un lavado con baja concentración de sal, para separar los contaminantes distintos de ARN de la membrana. Después se hace eluir el ARN de la membrana. Es digno de mención que en el presente método, el ácido nucleico de control interno se extraiga simultáneamente con el ácido nucleico de HCV presente en la muestra. En resumen, el control interno se lleva a cabo a través del método completo, y de este modo experimenta exactamente las mismas manipulaciones que el ARN de HCV. Esto se suma a la precisión de los resultados generados mediante el método.

El ARN aislado (ARN de HCV y control interno) se amplifica después por medio de un protocolo de RT-PCR convencional, preferiblemente utilizando los cebadores novedosos descritos en la presente memoria. Además de los reactivos de amplificación convencionales utilizados en la RT-PCR, también se añaden a la reacción dos sondas oligonucleotídicas marcadas distintas (no cebadores), una primera sonda que es específica para los amplicones de HCV y una segunda sonda que es específica para los amplicones del patrón interno. La segunda sonda se une a los amplicones del patrón interno por medio de la única región de unión a la sonda del control interno. De este modo, el ARN se convierte primero en un heterodúplex de ARN-ADN (esto es se genera una hebra de ADNc) por medio de la acción de una transcriptasa inversa (preferiblemente rTth). Después el ADNc es amplificado mediante PCR convencional para producir amplicones de ADN de doble hebra. La reacción de transcripción inversa que conduce al ADNc puede ser catalizada utilizando una transcriptasa que sea distinta de la polimerasa utilizada...

1. Un cebador que consiste en la secuencia del SEQ ID NO: 22 o uno de sus complementos.

2. El cebador de la Reivindicación 1, donde el cebador está marcado.

3. El cebador de la Reivindicación 1, donde el cebador está marcado con un hapteno.

4. Un método para cuantificar una cantidad de ácido nucleico genómico del virus de la hepatitis C (HCV) en una muestra de ensayo, comprendiendo el método:

5. Un kit para cuantificar una cantidad de ácido nucleico genómico del virus de la hepatitis C (HCV) en una muestra de ensayo, comprendiendo el kit combinados: