METODO DE DETECCION DEL VIRUS DEL MOSAICO DEL PEPINO DULCE.
Método de detección del virus del mosaico del pepino dulce.La presente invención se refiere a un método para la detección e identificación de aislados del PepMV en una muestra vegetal,
basado en las siguientes etapas: a) extracción del ARN total de la muestra vegetal; b) análisis del ARN extraído en a) mediante una reacción de amplificación RT-PCR en un solo paso incluyendo en la reacción una mezcla que comprende un oligonucleótido de secuencia SEQ ID No1 y un oligonucleótido seleccionado entre los oligonucleótidos de secuencia SEQ ID No2, SEQ ID No3, SEQ ID No4 y sus combinaciones; c) identificación de los productos de amplificación obtenidos en b); d) digestión con enzimas de restricción de los productos de amplificación identificados en c); y e) identificación de los productos de la digestión realizada en d). Asimismo, se contempla un kit para llevar a cabo el método descrito
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200703320.
Solicitante: UNIVERSIDAD POLITECNICA DE VALENCIA.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: VALENCIA.
Inventor/es: PALLAS BENET,VICENTE, SANCHEZ-NAVARRO,JESUS ANGEL, CORDOBA SELLES,CARMEN, ALFARO FERNANDEZ,ANA, JORDA GUTIERREZ,M. CONCEPCION, GARCIA RANDEZ,ANA, CEBRIAN MICO,MARIA CARMEN.
Fecha de Solicitud: 5 de Diciembre de 2007.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 28 de Enero de 2011.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07H21/04 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
- C12Q1/68 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Clasificación PCT:
Fragmento de la descripción:
Método de detección del virus del mosaico del pepino dulce.
Campo de la invención
La presente invención pertenece al sector técnico de la diagnosis de enfermedades virales, concretamente a aquellas producidas por el virus del mosaico del pepino dulce (PepMV) en plantas. En particular, la presente invención contempla un método para la detección e identificación simultánea de aislados específicos del PepMV en muestras vegetales.
Antecedentes de la invención
El virus del mosaico del pepino dulce (Pepino Mosaic Virus, PepMV) es un Potexvirus que fue descrito por primera vez en pepino dulce (Solanum muricatum Ait.) en Perú (Jones, RAC, Koening, R., and Lesemann, D. E. 1980. Pepino mosaic virus, a new Potexvirus from pepino (Solanum muricatum). Annals of Applied Biology 94: 61-68). En 1999, se detectó en Holanda afectando a tomate (Van der Vlugt, R.A.A., Stijger, C.C., Verhoeven, J. T. J. and Lesermann, D.E. 2000. First report of Pepino mosaic virus in tomato. Plant Disease 84: 103). Desde entonces, el PepMV se ha expandido rápidamente por las principales áreas productoras de tomate del mundo. Este virus se ha convertido en uno de los principales problemas en la producción de tomate en Europa, donde causa importantes pérdidas económicas.
Actualmente se conocen diferentes aislados del virus que afectan al tomate. En un primer momento, debido a las diferencias biológicas y moleculares observadas entre el aislado del PepMV que infectaba a tomate y el original de pepino dulce, distintos autores consideraron el aislado de tomate como un aislado diferente, denominándolo aislado tipo tomate (Van der Vlugt, R.A.A. and Berendsen, M. 2002. Development of a general Potexvirus detection method. European Journal of Plant Pathology 108:367-371). Estudios posteriores demostraron que los aislados de PepMV de Europa, América del Norte y Canadá, comparados con el aislado original de pepino dulce, presentaban diferencias evidentes en sintomatología así como diferencias a nivel de secuencia nucleotídica (Verhoeven, J.T.J., Van der Vlugt, R.A.A., Roenhorst, J.W. 2003. High similarity between tomato isolates of Pepino mosaic virus suggest a common origin. European Journal of Plant Pathology 109: 419-425).
Se han realizado estudios de variabilidad genética y estructura poblacional del PepMV en cultivo de tomate en España, analizando y secuenciando tres zonas distintas del genoma del virus: una parte del gen de la ARN polimerasa ARN dependiente (RdRp), el bloque de genes triple (triple-gene block) (TGB) y el gen de la proteína de la cápside (CP). Los resultados de este estudio revelaron que el genotipo presente en mayor proporción en nuestro país era el aislado Europeo tipo tomate. Con menos frecuencia relativa, se encontraban el aislado peruano y el aislado americano US2, presentándose habitualmente en infecciones mixtas con el aislado europeo. Asimismo se detectó la presencia de aislados recombinantes (Pagán, I., Córdoba-Sellos, M. C., Martínez-Priego, L., Fraile, A., Malpica, J. M., Jordá, C. and García-Arenal, F. 2006. Genetic Structure of the Population of Pepino mosaic virus Infecting Tomato Crops in Spain. Phytopathology 96: 274-279). Recientemente han aparecido dos aislados identificados como aislados chilenos: Ch1 (accession number: DQ000984) y Ch2 (accession number: DQ000985).
A lo largo de su historia se han publicado diferentes métodos de detección e identificación del virus PepMV: Microscopía electrónica inmunoabsorbente (ISEM) (Van der Vlugt, R.A.A., Stijger, C.C., Verhoeven, J. T. J. and Lesermann, D.E. 2000. First report of Pepino mosaic virus in tomato. Plant Disease 84: 103), técnica serológica ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (Jordá, C., Lázaro- Pérez, A., Martínez-Culebras, P. and Abad- Campos, P. 2001. First report of Pepino mosaic virus on tomato in Spain. Plant Disease 85: 1292) y técnicas moleculares como la RT-PCR (reverse transcriptase-polymerare reaction) con la posterior secuenciación del DNA obtenido (Mumford, R.A. and Metcalfe, E.J. 2001. The partial sequencing of the genomic RNA of a UK isolateof Pepino mosaic virus and the comparison of the coat protein sequence with othes isolates from Europe and Peru. Archives of Virology 146:2455-2460), (Van der Vlugt, R.A.A., Stijger, C. C., Verhoeven, J. T. J. and Lesermann, D.E. 2000. First report of Pepino mosaic virus in tomato. Plant Disease 84: 103). Hasta este momento, únicamente podían ser identificados tres tipos de aislados simultáneamente mediante una RT-PCR seguida de un análisis de restricción (RFLPs) (Martínez-Culebras, P.V., Lázaro, A., Abad-Campos, P. and Jordá, C. 2002. A RT-PCR assay combined with RFLP analysis for detection and differentiation of isolates of Pepino mosaic virus (PepMV) from tomato. European Journal of Plant Pathology 108: 887-892). Para diferenciar otros aislados la secuenciación era el único medio posible.
En los últimos años, se ha puesto a punto una nueva técnica molecular, la multiplex RT-PCR, que permite el diagnóstico rutinario de diferentes virus vegetales (Nie, X. and Sigh, R. P. 2000. Detection of multiple potato viruses using an oligo (dT) as a common cDNA primer in multiplex RT-PCR. Journal of Virological Methods 86:179-185); (Sánchez-Navarro, J. A., Aparicio, F., Herranz, M. C., Minarfa, A., Myrta, A. and Pallás, V. 2005. Simultaneous detection and identification of eight stone fruit viruses by one-step RT-PCR. European Journal of Plant Pathology 111:77-84); (Uga, H., and Tsuda, S. 2005. A one-step reverse transcription-polymerase chain reaction system for the simultaneous detection and identification of multiple Tospovirus infections. Phytopathology 95:166-171). Este método de diagnóstico permite la detección e identificación simultánea de diferentes virus con menor coste económico y temporal. Esta técnica, además de para la diferenciación de entidades virales, también se ha desarrollado para identificar diferentes razas o aislados dentro de un mismo virus (Lorenzen, J. H., Piche, L.M., Gudmestad, N.C., Meacham, T., Shiel, P. 2006. A multiplex PCR assay to characterize Potato virus Y isolates and identify strain mixtures. Plant Disease 90: 935-940).
Los autores de la presente invención han diseñado cuatro nuevos cebadores u oligonucleótidos específicos de PepMV en base a los cuales han desarrollado un nuevo método de diagnóstico que permite, mediante el empleo de la técnica molecular multiplex RT-PCR en un solo paso, seguida de un análisis de restricción, la detección e identificación en una muestra vegetal de hasta cinco aislados de PepMV simultáneamente. Esta técnica es muy útil en el campo de la patología para caracterizar el aislado del virus presente en una determinada muestra de manera rápida, específica, eficaz y económica, sin tener que recurrir a la posterior secuenciación de DNA.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Representación esquemática de la localización de los cebadores de secuencia SEQ ID NO1-4, producto obtenido para cada grupo de aislados de PepMV y análisis de restricción.
Figura 2: Representación esquemática del resultado obtenido a partir de la Multiplex RT-PCR en los aislados individuales (E/P; CH1/US1 y CH2/US2) y en las infecciones mixtas (I.M.) empleando los oligonucleótidos de secuencia SEQ ID NO 1-4 (M: marcador de pesos moleculares).
Figura 3: Representación esquemática de los resultados de las digestiones con Sac I y Hpa I a partir de los productos amplificados mediante Multiplex RT-PCR del grupo Europeo/Peruano y Chileno 2/US2. (M: marcador de pesos moleculares).
Objeto de la invención
En primer lugar, es objeto de la invención un método para la detección e identificación simultánea de aislados específicos del PepMV basado en el empleo de un oligonucleótido de secuencia SEQ ID No1 y un oligonucleótido seleccionado entre los oligonucleótidos de secuencia SEQ ID No2, SEQ ID No3, SEQ ID No4 y sus combinaciones.
Son también objeto de la invención cada uno de los oligonucleótidos de secuencias SEQ ID No1, SEQ ID No2, SEQ ID No3 y SEQ ID No4.
Es también objeto de la invención el empleo de cualquiera de los oligonucleótidos citados, o de combinaciones de los mismos, en la detección e identificación de aislados del PepMV en una muestra vegetal.
Finalmente, es objeto de la invención un kit para llevar a cabo el método para la detección simultánea de la presencia o ausencia de aislados específicos...
Reivindicaciones:
1. Método para la detección e identificación simultánea en una muestra vegetal de aislados específicos del PepMV, seleccionados de entre CH2, US2, CH1/US1, europeo, peruano y sus combinaciones, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
2. Método, según la reivindicación 1, donde el empleo de la mezcla de los oligonucleótidos de SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 en la etapa b) permite la detección e identificación del grupo de aislados europeo/peruano en la etapa c).
3. Método, según la reivindicación 2, donde el empleo de la enzima de restricción Sacl, en la etapa d), permite la identificación simultánea de los aislados europeo y peruano en la etapa e).
4. Método, según la reivindicación 1, donde el empleo de la mezcla de los oligonucleótidos de SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 3 en la etapa b), permite la detección e identificación del grupo de aislados CH1/US1 en la etapa c).
5. Método, según la reivindicación 1, donde el empleo de la mezcla de los oligonucleótidos de SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 4, en la etapa b), permite la detección e identificación del grupo de aislados CH2/US2 en la etapa c).
6. Método, según la reivindicación 5, caracterizado porque el empleo de la enzima Hpal en la etapa d), permite la identificación simultánea de los aislados CH2 y US2 en la etapa e).
7. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque el empleo de una mezcla de los oligonucleótidos de secuencias SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4 en la etapa b) permite la detección e identificación simultánea de los grupos de aislados CH2/US2, CH1/US1 y europeo/peruano en la etapa c).
8. Método, según la reivindicación 7, caracterizado porque el empleo de las enzimas SacI y HpaI en la etapa d) permite la identificación simultánea de los 5 aislados Ch2, US2, Ch1/US1, europeo y peruano en la etapa e).
9. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las etapas de identificación c) y e) se llevan a cabo por electroforesis en gel de agarosa.
10. Oligonucleótido, con secuencia mostrada en SEQ ID NO 1, para su empleo en el método de la reivindicación 1.
11. Oligonucleótido, con secuencia mostrada en SEQ ID NO 2, para su empleo en el método de la reivindicación 1.
12. Oligonucleótido, con secuencia mostrada en SEQ ID NO 3, para su empleo en el método de la reivindicación 1.
13. Oligonucleótido, con secuencia mostrada en SEQ ID NO 4, para su empleo en el método de la reivindicación 1.
14. Uso de cualquiera de los oligonucleótidos de las reivindicaciones 10-13, o de combinaciones de los mismos, en la detección e identificación de aislados específicos del PepMV en una muestra vegetal.
15. Kit para llevar a cabo el método de la reivindicación 1, que comprende una solución formada por una mezcla de un oligonucleótido de SEQ ID NO 1 y otro oligonucleótido seleccionado entre los oligonucleótidos de secuencia SEQ ID NO 2-SEQ ID NO 4 y sus combinaciones, y una solución que comprende una enzima de restricción seleccionada entre HpaI y SacI.
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