Método para la detección precoz de patrones de frutales tolerantes al estrés salino.

La presente invención se refiere a un método para determinar la respuesta al estrés salino de patrones frutales que reduce el tiempo de selección clásica convencional y que se puede llevar a cabo en laboratorio mediante el crecimiento de raíces aisladas in vitro en presencia de concentraciones estresantes de cloruro sódico (NaCl). Este método aúna rapidez en la respuesta y un modelo experimental simplificado.

Método para la detección precoz de patrones de frutales tolerantes al estrés salino.

La presente invención se refiere a un método para determinar la respuesta al estrés salino de patrones frutales que reduce el tiempo de selección clásica convencional y que se puede llevar a cabo en laboratorio mediante el crecimiento de raíces aisladas in vitro en presencia de concentraciones estresantes de cloruro sódico (NaCl) . Este método aúna rapidez en la respuesta y un modelo experimental simplificado.

Estado de la técnica anterior La tolerancia de un cultivo a la reducción de la producción por salinidad es un carácter complejo, que involucra respuestas al estrés iónico y osmótico a nivel celular, la coordinación de esas respuestas a nivel de organismo y su interacción con el medio circundante (Cheeseman (1988) . Plant Physiol 87: 745-755; Yeo (1998) . Sci. Hort. 78:159174) .

Una de las aproximaciones al estudio de la tolerancia al estrés ha sido con el empleo de métodos estadísticos y mapeo genómico, con lo que se consigue asociar el fenotipo de un carácter cuantitativo con marcadores genéticos. Esto se consigue con el análisis de loci de caracteres cuantitativos o QTL (Quantitative Trait Locus) (Quarrie (1996) . Plant Growth Regulation 20: 167-178) . Uno de los problemas que plantea esta aproximación es que la identidad de los caracteres relacionados con la tolerancia a estrés salino no es el mismo para todos los cultivos y se desconocen QTL marcadores de estrés salino válidos para todas las especies o híbridos de patrones de árboles frutales.

La tolerancia al estrés salino está regulada por multitud de genes. Este carácter poligénico es el principal obstáculo para la mejora genética de las plantas de cultivo. Hasta la fecha actual no ha resultado fácil encontrar métodos apropiados para la selección de plantas tolerantes al estrés salino.

Una aproximación para la mejora de la tolerancia ha sido la selección o adaptación de suspensiones celulares o callos (cultivo de tejidos y multiplicación in vitro) bajo condiciones de salinidad y aprovechamiento de la variación somaclonal para posterior regeneración de plantas con mayor tolerancia. En algunos casos, este método dio fruto a individuos más tolerantes pero sin interés agronómico y en otros casos a cultivares que no han tenido una difusión comercial importante (Flowers y Yeo (1995) . Australian Journal of Plant Physioloqy 22: 875-884) .

La mejora de la tolerancia a la salinidad de especies leñosas por medio de la detección de los ejemplares tolerantes es difícil y costosa debido a que los ensayos en campo son lentos y los tratamientos de salinidad difíciles o con riesgo de salinización de la parcela. Para no perder sus características genéticas, que son diferentes a las de sus semillas, las especies leñosas se reproducen vegetativamente, ya que con el uso de plantas de semilla, a pesar de que la respuesta es más rápida, se desconoce el comportamiento agronómico de la planta evaluada y, por tanto, su interés; si se utilizan plantones en maceta los resultados se demoran hasta la preparación de la planta, que no siempre es posible, y hasta la obtención de la respuesta a la sal.

A pesar de la sensibilidad de los frutales a la salinidad, la elección de un patrón tolerante permite el cultivo en condiciones de baja salinidad (Ziska et al. (1991) . Tree Physiology 8: 47-57) por lo que la determinación del grado de tolerancia de los patrones tiene un gran interés ya que permitiría el cultivo en zonas con salinidad moderada.

Explicación de la invención La presente invención se refiere a un método para determinar la respuesta al estrés salino de patrones frutales que reduce el tiempo de selección clásica convencional y que se puede llevar a cabo en laboratorio mediante el crecimiento de raíces aisladas in vitro en presencia de concentraciones estresantes de cloruro sódico (NaCl) . Este método aúna rapidez en la respuesta y un modelo experimental simplificado y es fácilmente adaptable a otros estreses abióticos y otras especies.

Mediante la aplicación del método de la presente invención es posible determinar y distinguir entre patrones tolerantes y sensibles a la salinidad de especies leñosas utilizando tanto la medida del crecimiento de las raíces tras su cultivo in vitro como la medida del contenido de granos de almidón en cortes transversales de las raíces en la zona de respuesta de los tejidos, tras su cultivo durante un tiempo determinado, a un rango de concentración de NaCl (ver más adelante) .

El método de la presente invención aprovecha las ventajas de un modelo experimental simplificado, basado en las raíces, que son los órganos que están en contacto directo con el suelo, y por tanto con el NaCl. Por otra parte se evalúa la respuesta a un nivel de organización más sencillo, el histológico y celular, que manifiestan una respuesta más rápida que la de la planta completa, que integraría diferentes mecanismos fisiológicos. La aplicación de este método permite reducir el tiempo de selección en especies frutales.

En la presente invención se demuestra que los patrones del grupo ciruelo son los patrones más tolerantes a la salinidad y que los patrones del tipo cerezo están entre los menos tolerantes. Estos datos se corresponden con los datos de tolerancia a la salinidad de planta entera que demuestran la misma relación de tolerancia entre los patrones del grupo ciruelo y los del grupo cerezo, según se concluye de diversos trabajos que estudian la tolerancia de diversas especies de Prunus (Day (1953) . Calif. Agric. Exp. Sta. Serv. Bull. 736; Egea (1970) . ITEA 1: 157-164; Ottman y Byrne (1988) . HortScience 23: 375-378; Massai y Gucci (1998) . Acta Hort. 465: 363-369; Kotuby-Amacher et al. (2000) . Electronic Publication AG-SQ-03. Utah State Universitv Extensión. Logan; Bolat et al. (2006) . J. Plant Nutr.

29: 553-564) . De este modo, los resultados obtenidos en el cultivo in vitro de ápices de raíz aislados queda validado y por tanto, se puede afirmar que los patrones de frutales tolerantes al estrés salino seleccionados in vitro también serán tolerantes en planta entera.

La salinización de los suelos donde crecen frutales causa graves pérdidas económicas en los países mediterráneos, por lo que la posibilidad de disponer de materiales vegetales que sean resistentes al estrés salino supone un gran apoyo al sector frutícola.

El método de la presente invención tiene aplicación industrial en los sectores viverista o en el sector de los mejoradores de especies leñosas. En estos sectores industriales se puede aplicar el método de la presente invención como un criterio de selección precoz en sus programas de mejora, para poder seleccionar el material vegetal antes de realizar ensayos en el campo.

En este sentido, el principal aspecto de la presente invención es un método para la detección de patrones de frutales tolerantes al estrés salino que comprende:

a. Cultivar in vitro un fragmento apical de la raíz de un patrón de frutal en un medio de crecimiento que contiene una concentración de entre 40 y 80 mM de cloruro sódico (NaCl) ,

b. medir la longitud de la raíz del apartado (a) en un tiempo comprendido entre 14 y 28 días desde que se inició el cultivo,

c. comparar la longitud de la raíz con la longitud de la raíz de un control de referencia.

El término "patrón" tal como se entiende en la presente invención hace referencia a una planta sobre la que se injerta el árbol frutal de la variedad deseada que formará la parte aérea. El patrón también se conoce como portainjerto. Por tanto, el árbol frutal cultivado se caracteriza por estar formado por la unión de dos individuos por medio del injerto. El patrón o portainjerto es el que constituye el sistema radical y una parte del tronco, sobre el cual se injerta la yema, estaquilla o púa del otro (variedad de árbol frutal deseada) que formará en definitiva la copa o parte aérea y producirá los frutos. El patrón se usa para aportar resistencias a la variedad de frutal injertada frente a estreses causados principalmente a la parte radicular de la planta. Además, hay patrones que aumentan el vigor de la parte aérea, otros posibilitan la variación en la entrada en fructificación, influyen en la productividad, calidad de la fruta o maduración.

El término "tolerantes al estrés salino" hace referencia a la mayor capacidad de resistencia del patrón de la presente invención frente a determinadas concentraciones de NaCl (se describe más adelante)... [Seguir leyendo]

1. Método para la detección de patrones de frutales tolerantes al estrés salino que comprende:

a. Cultivar in vitro un fragmento apical de la raíz de un patrón de frutal en un medio de crecimiento que contiene una concentración de entre 10 y 80 mM de cloruro sódico (NaCl) ,

b. medir la longitud de la raíz del apartado (a) en un tiempo comprendido entre 14 y 28 días desde que se inició el cultivo,

c. comparar la longitud de la raíz con la longitud de la raíz de un control de referencia.

2. Método según la reivindicación 1 donde el medio de crecimiento contiene una concentración de entre 50 y 70 mM de NaCl.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones1ó2 donde se seleccionan los patrones de frutales cuya longitud media de las raíces es mayor o igual al 50% de la longitud media de las raíces del control de referencia.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones1ó2que además comprende

d. analizar el contenido de almidón de las raíces del apartado (b) hasta los primeros 20 mm medidos desde el ápice de la raíz y

e. comparar el contenido de almidón de las raíces con el contenido de almidón de las raíces de un control de referencia.

5. Método según la reivindicación 4 donde el medio de crecimiento contiene una concentración de entre 10 y 30 mM de NaCl.

6. Método según la reivindicación 5 donde el medio de crecimiento contiene una concentración de entre 15 y 25 mM de NaCl.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 donde se analiza el almidón en la zona comprendida entre 5 y 15 mm medidos desde el ápice de la raíz.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones4a7 donde se seleccionan los patrones de frutales cuya longitud media de las raíces es mayor o igual al 50% de la longitud media de las raíces del control de referencia y la cantidad media de granos de almidón es de entre el nº medio de granos de almidón de las raíces del control de referencia y el nº medio más 5.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde los patrones frutales son frutales que producen frutos con hueso.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones1a8 donde los patrones de frutales son del género Prunus.

11. Método según la reivindicación 10 donde los patrones de frutales se seleccionan de la lista que comprende Prunus insititia L., Prunus cerasifera x Prunus munsoniana, Prunus cerasus L. o Prunus dulcis x Prunus persica.

ES0203 707070B

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud:200803727

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 29.12.2008

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : A01H1/04 (2006.01) A01H4/00 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

35. 357.ISSN 0721-7714. <DOI:10.1007/s00299-003-0695-5> 1-11 A BRACCI, T. et al. In vitro olive (Olea europaea L.) cvs Frantoio and Moraiolo microshoot tolerance to NaCl. Plant Biosystems. Noviembre 2008. Vol. 142, Nº 3, página.

56. 571. ISSN 1126-3504. <DOI:10.1080/11263500802410918> 1-11 A HAMROUNI, L. et al. La culture in vitro : un moyen rapide et efficace pour selectionner des genotypes de vigne tolerant la salinite. Comptes Rendus-Biologies. 14 enero 2008. Vol. 331, Nº 2, páginas 152 -163. ISSN 1631-0691. <DOI:10.1016/j.crvi.2007.11.002> 1-11 A SINGH, A. et al. In vitro screening of citrus rootstocks for salt tolerance. Indian Journal of Genetics & Plant Breeding. Febrero 2004. Vol. 64, Nº 1, página.

5. 57. ISSN 0019-5200. 1-11 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 29.11.2010 Examinador E. Ulloa Calvo Página 1/6

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud:200803727

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 29.12.2008

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : A01H1/04 (2006.01) A01H4/00 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

55. 559. ISSN 0003-1062. 1-11 A JONES, M.P. Rapid Evaluation of Salt Tolerance Mangrove-Swamp Rice Varieties. Tropical Agriculture. 1990. Vol. 67, Nº 3, página.

19. 202. ISSN 0041-3216. 1-11 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 29.11.2010 Examinador E. Ulloa Calvo Página 2/6

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud:200803727

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) A01 Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS, XPESP, NPL, MEDLINE, EMBASE, COMPDX, INSPEC

Informe del Estado de la Técnica Página 3/6

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud:200803727

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 29.11.2010

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/6 Informe del Estado de la Técnica Página 5/6

35. 357. 12/2003 D02 BRACCI, T. et al. Noviembre 2008. Vol. 142, Nº 3, página.

56. 571. 11/2008 D03 HAMROUNI, L. et al. Comptes Rendus-Biologies. 14 enero 2008. Vol. 331, Nº 2, páginas 152 -163. 14/01/2008 D04 SINGH, A. et al. Indian Journal of Genetics & Plant Breeding. Febrero 2004. Vol. 64, Nº 1, página.

5. 57. 02/2004 D05 PICCHIONI G A et al. Journal of the American Society for Horticultural Science.1991. Vol.116, Nº 3, página.

55. 559. 1991 D06 JONES, M.P. Rapid Evaluation of Salt Tolerance Mangrove-Swamp Rice Varieties. Tropical Agriculture. 1990. Vol. 67, Nº 3, páginas199-202. 1990 La solicitud describe un método de detección precoz de patrones frutales tolerantes al estrés salino. El documento D01 mide in vitro la tolerancia a salinidad de distintos genotipos de mora a partir del cultivo de yemas axilares sobre un medio salino a distintas concentraciones de cloruro sódico. Los parámetros considerados para evaluar esa tolerancia son el crecimiento de brotes y el enraizamiento y la longitud de las raíces. En sus antecedentes habla de que algunos autores no consideran adecuado el crecimiento de los brotes en medio salino como indicador de esa tolerancia, y que en cambio sería un buen indicador la medición del crecimiento de las raíces. El documento D02 analiza in vitro la tolerancia a la sal de microbrotes de olivos mediante la medición de parámetros clave, como son la longitud y el peso de las raíces crecidas a distintas concentraciones de sal. Concluye que indicadores relacionados con raíces quizás sean los más adecuados para medir la tolerancia a salinidad de genotipos, a través del cultivo in vitro de brotes. El documento D03 describe un método rápido de detección de patrones frutales (de viñedos) tolerantes al estrés salino a través del cultivo in vitro de yemas axilares en un medio de crecimiento con distintas concentraciones de cloruro sódico (20 y 50 mM entre ellas) . Analiza la tolerancia en función de la respuesta del cultivo en cuanto a crecimiento, desarrollo y enraizamiento. Establece una correlación positiva entre la vigorosidad del patrón en medio salino y su tolerancia a la sal. El tiempo de cultivo es de 45 días. Los brotes con yemas se obtienen tras cultivar trozos de sarmiento del patrón previamente estilizados. El documento D04 determina la tolerancia de patrones cítricos al estrés salino mediante el cultivo in vitro de callos en medio salino durante 6 semanas y posterior evaluación de los mismos. El documento D05 describe un test rápido de determinación de la tolerancia a la sal de patrones de pistacho. Parte de puntas de raíz de las semillas que lleva al laboratorio para simular situaciones de estrés salino. Mide posteriormente los solutos, llegando a la conclusión de que fugas de los mismos en las raíces, que además conlleva un crecimiento menor de las mismas, es un indicador de esa tolerancia. El documento D06 evalúa la tolerancia a salinidad de distintas variedades de arroz mediante la medición de la longitud de las raíces de semillas cultivadas en medio salino durante 4 semanas.

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud:200803727

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 6.1 y 8.1 L.P.)

El objeto técnico de la solicitud es la detección de patrones frutales tolerantes al estrés salino mediante el cultivo in vitro de un fragmento apical de la raíz sobre medio salino y posterior comparación de la longitud de la raíz crecida con la longitud de la raíz de un control de referencia. Las reivindicación dependiente 4 se refiere a la medición de un parámetro extra para evaluar la tolerancia: el contenido de almidón de esa raíz. Los patrones tolerantes seleccionados son aquellos con longitud media de sus raíces >50% respecto al control y con una cantidad media de granos de almidón igual, o más cinco, respecto al control.

Son conocidos en el estado de la técnica distintos procedimientos in vitro de detección de especies tolerantes al estrés salino, mediante el cultivo in vitro de tejidos de la especie a evaluar sobre distintas concentraciones de sal, y posterior evaluación de parámetros que determinan esa tolerancia (crecimiento, vigorosidad, formación de brotes, enraizamiento, …) . Entre las especies existentes algunas se corresponden con patrones frutales (D02-D05) . Por otra parte, la medición de la longitud de la raíz como parámetro para determinar la tolerancia ya es conocido por los documentos D01, D02 y D06 evaluando variedades de mora, olivo o arroz.

Sin embargo, no se ha encontrado ningún documento en el estado de la técnica que determine la tolerancia de un patrón frutal mediante el cultivo in vitro de fragmentos apicales de raíz en medio salino para posteriormente analizar la longitud crecida de esa raíz respecto a un control de referencia.

Por tanto, y a la vista del estado de la técnica conocido, las reivindicaciones 1-11 cumplen con el requisito de novedad y actividad inventiva.

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