Método para el descubrimiento, la detección y el genotipado de alto rendimiento de uno o más marcadoresgenéticos en una o más muestras,

que comprende las etapas de:

(a) proporcionar ADN de una o más muestras;

(b) cortar el ADN con al menos una endonucleasa de restricción para producir fragmentos de restricción;

(c) ligar adaptadores a los fragmentos de restricción para producir fragmentos de restricción ligados a adaptador;

(d) amplificar los fragmentos de restricción ligados a adaptador con un par de cebadores que es complementario alos adaptadores para producir fragmentos de restricción ligados a adaptador preamplificados;

(e) amplificar los fragmentos de restricción ligados a adaptador preamplificados con un par de cebadores,conteniendo al menos uno de los cebadores desde uno hasta 10 nucleótidos selectivos en su extremo 3' yconteniendo al menos uno de los cebadores una etiqueta identificadora en el extremo 5' del cebador para produciruna biblioteca de subconjuntos amplificados etiquetados de fragmentos de restricción ligados a adaptador para cadamuestra;

(f) opcionalmente, agrupar las bibliotecas;

(g) secuenciar las bibliotecas, comprendiendo la secuenciación las etapas de:

- aparear los fragmentos de restricción ligados a adaptador con perlas, apareándose cada perla con un únicofragmento ligado a adaptador;

- emulsionar las perlas en microrreactores de agua en aceite, comprendiendo cada microrreactor de agua en aceiteuna única perla;

- realizar una PCR en emulsión para amplificar los fragmentos de restricción ligados a adaptador en la superficie delas perlas;

- cargar las perlas en pocillos, comprendiendo cada pocillo una única perla; y

- generar una señal de pirofosfato;

(h) agrupar las secuencias por biblioteca, usando la etiqueta identificadora;

(i) identificar marcadores genéticos dentro de la biblioteca y/o entre bibliotecas

(j) determinar genotipos (co)dominantes de los marcadores genéticos en una o más bibliotecas.

Método para la detección de polimorfismos basados en AFLP de alto rendimiento

Campo técnico

La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular y la genética. La invención se refiere al descubrimiento, detección y genotipado a gran escala rápidos de polimorfismos en una muestra de ácido nucleico o entre muestras. Los polimorfismos identificados pueden usarse como marcadores genéticos.

Antecedentes de la invención

La exploración del ADN genómico ha sido largamente deseada por la comunidad científica, en particular médica. El ADN genómico tiene la clave para la identificación, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades tales como cáncer y enfermedad de Alzheimer. Además de la identificación y el tratamiento de enfermedades, la exploración del ADN genómico puede proporcionar ventajas significativas en esfuerzos de cría de animales y plantas, lo que puede proporcionar respuestas a problemas de alimentación y nutrición en el mundo.

Se sabe que muchas enfermedades están asociadas con componentes genéticos específicos, en particular con polimorfismos en genes específicos. La identificación de polimorfismos en muestras grandes tales como genomas es en la actualidad una tarea laboriosa y que requiere mucho tiempo. Sin embargo, tal identificación es de gran valor en áreas tales como la investigación biomédica, el desarrollo de productos farmacológicos, la tipificación de tejidos, el genotipado y los estudios poblacionales.

Los marcadores, es decir, los marcadores genéticos, se han usado durante mucho tiempo como método de tipificación genética, es decir para conectar un rasgo fenotípico con la presencia, ausencia o cantidad de una parte particular de ADN (gen) . Una de las tecnologías de tipificación genética más versátiles es AFLP, ya presente desde hace muchos años y ampliamente aplicable a cualquier organismo (para revisiones, véase Savelkoul et al. J. Clin. Microbiol, 1999, 37 (10) , 3083-3091; Bensch et al. Molecular Ecology, 2005, 14, 2899-2914)

La tecnología de AFLP (Zabeau & Vos, 1993; Vos et al., 1995) ha encontrado un uso generalizado en el cultivo de plantas y otros campos desde su invención a principios de los años 1990. Esto se debe a varias características de AFLP, siendo la más importante que no se necesita información de secuencia previa para generar grandes números de marcadores genéticos de manera reproducible. Además, el principio de amplificación selectiva, la piedra angular de AFLP, garantiza que el número de fragmentos amplificados pueda hacerse corresponder con la resolución del sistema de detección, independientemente del origen o el tamaño del genoma.

La detección de fragmentos de AFLP se lleva a cabo comúnmente mediante electroforesis en geles planos (Vos et al., 1995) o electroforesis capilar (van der Meulen et al., 2002) . La mayoría de los marcadores de AFLP puntuados de esta forma representan polimorfismos (de un solo nucleótido) que se producen o bien en los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción usados para la preparación de moldes para AFLP o bien en sus nucleótidos flanqueantes cubiertos por cebadores selectivos de AFLP. El resto de los marcadores de AFLP son polimorfismos de inserción/deleción que se producen en las secuencias internas de los fragmentos de restricción y una fracción muy pequeña de sustituciones de un solo nucleótido que se producen en pequeños fragmentos de restricción (< aproximadamente 100 pb) , que para estos fragmentos producen variaciones de movilidad reproducibles entre ambos alelos; estos marcadores de AFLP pueden puntuarse de manera codominante sin tener que basarse en intensidades de banda.

En una huella genética de AFLP típica, los marcadores de AFLP constituyen por tanto la minoría de los fragmentos amplificados (menos del 50 por ciento pero a menudo menos del 20 por ciento) , mientras que el resto se denomina comúnmente fragmentos de AFLP constantes. Estos últimos son útiles no obstante en el procedimiento de puntuación en gel, ya que sirven como puntos de anclaje para calcular movilidades de fragmentos de marcadores de AFLP y para ayudar a cuantificar los marcadores para la puntuación codominante. La puntuación codominante (puntuación para homo o heterocigosidad) de marcadores de AFLP está restringida actualmente al contexto de obtener la huella genética de una población segregante. En un panel de líneas no relacionadas, sólo es posible la puntuación dominante.

Aunque el rendimiento de AFLP es muy alto debido a los altos niveles de multiplexación en las etapas de amplificación y detección, la etapa limitante de la velocidad es el poder de resolución de la electroforesis. La electroforesis permite la identificación única de la mayoría de los fragmentos amplificados basándose en la combinación de combinaciones de enzimas de restricción (EC) , combinaciones de cebadores (PC) y movilidad, pero de manera ideal, el sistema de detección debe poder determinar toda la secuencia de los fragmentos amplificados para capturar todos los polimorfismos.

La detección mediante secuenciación en lugar de la determinación de la movilidad aumentará el rendimiento porque: 1) Se detectará el polimorfismo ubicado en las secuencias internas en la mayoría de (o en todos) los fragmentos amplificados; esto aumentará el número de marcadores por PC considerablemente.

2) No hay pérdida de marcadores de AFLP debido a la co-migración de marcadores de AFLP y a las bandas constantes.

3) La puntuación codominante no se basa en la cuantificación de intensidades de banda y es independiente del parentesco de los individuos de los que se obtiene la huella genética. Hasta ahora, la detección de secuencias/marcadores de AFLP mediante secuenciación no ha sido económicamente factible debido a, entre otras limitaciones, limitaciones de coste de la tecnología de secuenciación didesoxi de Sanger y de otras tecnologías de secuenciación convencionales.

Por consiguiente, uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar métodos económicamente factibles para la detección de marcadores de AFLP u otros marcadores genéticos tales como marcadores de SNP basándose en secuenciación.

Un problema importante asociado adicionalmente con la detección de un conjunto de fragmentos que contienen AFLP o SNP a través de secuenciación para fines de genotipado (es decir diagnóstico) es el de la variación de las muestras.

Específicamente, esto significa que cuando se analiza un conjunto de fragmentos y no se observan fragmentos particulares, ha de estarse seguro de que esto no se debe al hecho de que los fragmentos implicados no se tomaron como muestra en la etapa de detección, aunque estén presentes en la mezcla de fragmentos, porque esto conduciría a una puntuación falsa-negativa del marcador. Esta limitación no se aplica a la detección mediante electroforesis porque se dispone de la información de posición en el gel. Por consiguiente, uno de los objetivos adicionales de la presente invención es proporcionar un método que resuelva el problema de la variación de la muestra o que al menos reduzca los errores producidos por la variación de la muestra hasta un mínimo aceptable. El documento WO2005003375 describe un método de secuenciación de alto rendimiento basado en fragmentación de ADN, ligamiento de adaptador, PCR en emulsión y pirosecuenciación.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han encontrado que la secuenciación está al alcance para la detección de marcadores de AFLP y SNP con el uso de AFLP en determinados procedimientos adaptados para la secuenciación de alto rendimiento. La invención proporciona por tanto un método o estrategia que combina la potencia y la aplicabilidad genérica de AFLP con determinadas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para establecer un sistema de puntuación de polimorfismo aplicable genéricamente. En esta estrategia, en la cuestión de la toma de muestras, tal como se define en las reivindicaciones, la variación también se refiere a garantizar el genotipado con alta exactitud y maximizando las posibilidades de conjuntos de datos con números mínimos de genotipos que falten.

Definiciones

En la siguiente descripción y ejemplos se usan varios términos. Con el fin de proporcionar una comprensión clara y constante de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que va a darse a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones.... [Seguir leyendo]

1. Método para el descubrimiento, la detección y el genotipado de alto rendimiento de uno o más marcadores genéticos en una o más muestras, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar ADN de una o más muestras;

(b) cortar el ADN con al menos una endonucleasa de restricción para producir fragmentos de restricción;

(c) ligar adaptadores a los fragmentos de restricción para producir fragmentos de restricción ligados a adaptador;

(d) amplificar los fragmentos de restricción ligados a adaptador con un par de cebadores que es complementario a los adaptadores para producir fragmentos de restricción ligados a adaptador preamplificados;

(e) amplificar los fragmentos de restricción ligados a adaptador preamplificados con un par de cebadores, conteniendo al menos uno de los cebadores desde uno hasta 10 nucleótidos selectivos en su extremo 3’ y conteniendo al menos uno de los cebadores una etiqueta identificadora en el extremo 5’ del cebador para producir una biblioteca de subconjuntos amplificados etiquetados de fragmentos de restricción ligados a adaptador para cada muestra;

(f) opcionalmente, agrupar las bibliotecas;

(g) secuenciar las bibliotecas, comprendiendo la secuenciación las etapas de:

- aparear los fragmentos de restricción ligados a adaptador con perlas, apareándose cada perla con un único fragmento ligado a adaptador;

- emulsionar las perlas en microrreactores de agua en aceite, comprendiendo cada microrreactor de agua en aceite una única perla;

- realizar una PCR en emulsión para amplificar los fragmentos de restricción ligados a adaptador en la superficie de las perlas;

- cargar las perlas en pocillos, comprendiendo cada pocillo una única perla; y

- generar una señal de pirofosfato;

(h) agrupar las secuencias por biblioteca, usando la etiqueta identificadora;

(i) identificar marcadores genéticos dentro de la biblioteca y/o entre bibliotecas

(j) determinar genotipos (co) dominantes de los marcadores genéticos en una o más bibliotecas.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el marcador genético es un marcador AFLP o un marcador SNP.

3. Método según las reivindicaciones 1-2, en el que la redundancia promedio de los fragmentos de restricción ligados a adaptador amplificados etiquetados es de al menos 6, preferiblemente al menos 7, más preferiblemente al menos 8 y lo más preferiblemente al menos 9.

4. Método según las reivindicaciones 1-3, en el que la secuencia de cada fragmento de restricción ligado a adaptador se determina al menos 6, preferiblemente al menos 7, más preferiblemente al menos 8 y lo más preferiblemente al menos 9 veces.

5. Método según las reivindicaciones 1-4, en el que entre la restricción por endonucleasa y el ligamiento del adaptador se realiza una selección por tamaño mediante una etapa de desnaturalización.

6. Método según las reivindicaciones 1-7, en el que el ADN se selecciona del grupo que consiste en ADN genómico, ARN, ADNc, BAC, YAC, ADN amplificado de genoma completo, producto de PCR.

7. Método según las reivindicaciones 1-6, en el que el adaptador es un adaptador oligonucleotídico sintético bicatenario que tiene un extremo que es compatible con uno o ambos extremos de los fragmentos de restricción.

8. Método según las reivindicaciones 1-7, en el que el ADN se corta con al menos dos, preferiblemente tres o más endonucleasas de restricción.

9. Método según las reivindicaciones 1-8, en el que el ADN se corta con dos endonucleasas de restricción.

10. Método según las reivindicaciones 1-9, en el que al menos una de las endonucleasas de restricción tiene un

sitio de reconocimiento poco frecuente. 5

11. Método según las reivindicaciones 1-10, en el que al menos una de las endonucleasas de restricción tiene un sitio de reconocimiento frecuente.

12. Método según las reivindicaciones 1-11, en el que el cebador contiene desde uno hasta 5 (preferiblemente 10 seleccionados al azar de entre A, C, T o G) nucleótidos selectivos.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ADN se corta usando una combinación de tres o más endonucleasas de restricción.

14. Uso del método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la puntuación codominante de secuencias marcadoras AFLP y/o SNP.

15. Uso del método según cualquiera de las reivindicaciones de método anteriores, para fines de genotipado incluyendo mapeo genético, mapeo QTL, mapeo fino de genes/rasgos, mapeo de desequilibrio de enlace (LD) ,

retrocruzamiento asistido por marcador, análisis de distancia genética, descubrimiento de marcadores vinculados a rasgos o fenotipos, genotipado diagnóstico de muestras de pacientes.