El método para la detección e identificación de Peronospora arborescens se basa en la amplificación de regiones específicas de dicho patógeno.

Para ello, se han diseñado unos oligonucleótidos cebadores específicos de P. arborescens que permiten, mediante una reacción de amplificación enzimática, identificar y detectar dicho patógeno. De aplicación en Agricultura. Este método permite un diagnóstico temprano de la enfermedad (Mildiu) durante estados asintomáticos de la planta, lo que facilita el control eficiente de la misma, así como la certificación sanitaria de la semilla evitando la distribución del patógeno a zonas de cultivo donde no está presente

Método para la detección e identificación de Peronospora arborescens.

Campo de la invención

La invención se relaciona, en general, con la detección de patógenos de plantas y, en particular, con un método para la detección e identificación de Peronospora arborescens, basado en la amplificación de regiones específicas de dicho patógeno.

Antecedentes de la invención

La adormidera (Papaver somniferum), la única fuente de los fármacos alcaloides (morfina, codeína y tebaína) para la industria farmacéutica, puede ser gravemente afectada por el Mildiu, una de las enfermedades más destructivas de este cultivo en todo el mundo, que puede ser causada por Peronospora arborescens y por Peronospora cristata (Scott, J., et al., 2004. Phylogenetic analysis of the downy mildew pathogen of oilseed poppy in Tasmania, and its detection by PCR. Mycol. Res. Vol. 108: 198-295).

Durante los últimos años, el rendimiento de los cultivos de adormidera en España ha disminuido como consecuencia del ataque de varias enfermedades, incluyendo la Necrosis de la adormidera ("Poppy fire") causada por Pleospora papaveracea (anamorfo = Dendryphion penicillatum), y el Mildiu de la adormidera, causado por P. arborescens (Landa, B., et al., 2005. First report of downy mildew of opium poppy caused by Peronospora arborescens in Spain. Plant.Dis. Vol. 89: 338).

En España, se cultivan alrededor de 7.500 hectáreas de adormidera anualmente, principalmente en las regiones meridional (Andalucía) y central (Castilla-La Mancha y Castilla-León) del país, lo que representa al menos el 4% de la adormidera cultivada de manera legal en todo el mundo, haciendo de España el quinto mayor productor europeo de semillas y paja de adormidera.

La rápida propagación del Mildiu a zonas en las que antes no se había cultivado la adormidera, junto con la agregación de las plantas enfermas en rodales y el aumento progresivo de la incidencia y gravedad de la enfermedad durante los últimos anos, sugiere que P. arborescens ha sido introducido en semillas infectadas, lo que ha despertado la necesidad de desarrollar métodos de detección específicos de dicho patógeno en semillas y plantas de adormidera, para evitar la dispersión del agente causal del Mildiu a zonas de cultivo de la adormidera libres de P. arborescens.

Además de su uso para estudios filogenéticos, las secuencias de las regiones espaciadoras internas (ITS) de ADN ribosómico (ADNr) han demostrado ser útiles en el desarrollo de protocolos de PCR específicos de la especie para la detección e identificación in planta de hongos patógenos de la planta. Debido a la naturaleza de biotrofos estrictos de los Peronosporales, la disponibilidad de protocolos moleculares para su detección e identificación in planta y en semillas es particularmente importante para la puesta en práctica de programas de certificación sanitaria de la planta y el cultivo. Tal tecnología de diagnóstico debe ser, por tanto, lo suficientemente sensible como para detectar pequeñas cantidades de patógeno antes de la expresión evidente de los síntomas en el huésped, y lo suficientemente específica como para evitar problemas de reacción cruzada con otros patógenos relacionados.

Entre las técnicas moleculares desarrolladas actualmente para la detección de patógenos, normalmente es necesario llevar a cabo un protocolo de PCR anidada para aumentar la flexibilidad y la sensibilidad en la amplificación del ADN patógeno procedente de muestras vegetales infectadas (Silvar, C., et al., 2005. Development of specific PCR primers for identification and detection of Phytophthora capsici Leon. Eur. J. Plant Pathol. Vol. 112: 43-52.). Sin embargo, la sensibilidad de la detección decrece en una o dos veces tanto en la PCR anidada como en la PCR simple cuando el ensayo se realiza en presencia del ADN de la planta huésped Pap. somniferum (Silvar, et al., 2005, citado at supra). Asimismo, en los ensayos de PCR en tiempo real cuantitativos desarrollados para cuantificar Phytophthora spp. en hojas necrosadas (Schena, L. et al., 2006. Detection and quantification of Phytophthora ramorum, P. kernoviae, P. citricola and P. quercina in symptomatic leaves by multiplex real-time PCR. Mol. Plant Pathol. Vol. 7: 365-379), y Alternaria brassicae en semillas de crucíferas (Guillemette, T., et al., 2004. Conventional and real-time PCR based assay for detecting pathogenic Alternaria brassicae in cruciferous seed. Plant Dis. Vol. 88: 490-496), las desviaciones estándar de los replicados aumentaron enormemente a una concentración de ADN de patógeno menor de 1 pg, o cuando en la mezcla de reacción está presente ADN del huésped, reduciendo así la exactitud de la técnica cuantitativa.

Por otro lado, en los protocolos de PCR simple desarrollados para la detección de P. cristata en Tasmania se suelen producir reacciones cruzadas cuando los cebadores pdm3/pdm4 específicos de P. cristata diseñados por Scott et al., 2004 (citado at supra) se utilizan empleando como ADN molde el extraído de P. arborescens que ha infectado adormidera en España. Ello indica la necesidad de desarrollar nuevos iniciadores y protocolos que garanticen la diferenciación entre las dos especies patogénicas de adormidera durante los procesos de detección; y en razón de lo anterior, la sensibilidad, especificidad y robustez de dichos protocolos deben ser suficientes para obviar los inconvenientes que se han señalado para otros métodos de detección molecular (Guillemette, T., et al., 2004; Silvar, et al., 2005, Schena, L. et al., 2006, citados at supra).

Compendio de la invención

Peronospora arborescens es un hongo patógeno responsable, entre otras, de la enfermedad de Mildiu velloso de la adormidera (Papaver somniferum). El desarrollo de un método de identificación y detección específico de dicho patógeno, permite un diagnóstico temprano de la enfermedad útil en el control sanitario de la misma, evitando de este modo la distribución del patógeno.

El protocolo de PCR específico de P. arborescens desarrollado en esta invención solventa los inconvenientes que presentan las técnicas actuales porque muestra:

La invención se relaciona, por tanto, con un método para la identificación y detección de P. arborescens en una muestra biológica que comprende:

El método de la invención comprende una reacción de amplificación enzimática utilizando unos oligonucleótidos cebadores específicos de P. arborescens. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un oligonucleótido seleccionado del grupo formado por los oligonucleótidos identificados por SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una pareja de oligonucleótidos formada por los oligonucleótidos identificados por las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (P2).

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una pareja de oligonucleótidos según la invención, en una reacción de amplificación...

1. Un método para la identificación y detección de Peronospora arborescens en una muestra biológica que comprende:

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra biológica es (i) una muestra de material vegetal, o (ii) una muestra de estructuras de P. arborescens.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicha muestra de material vegetal se selecciona entre tejidos de semillas, cubiertas de semillas, hojas, tallos, cápsulas, raíces y mezclas de las mismas.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha muestra biológica está infectada por P. arborescens.

5. Método según la reivindicación 2, en el que dicha muestra de estructuras de P. arborescens contiene micelio, esporangios, esporangióforos u oosporas.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra biológica procede de Papaver somniferum.

7. Un oligonucleótido seleccionado del grupo formado por los oligonucleótidos identificados por SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

8. Una pareja de oligonucleótidos formada por los oligonucleótidos identificados por las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (P2).

9. Empleo de una pareja de oligonucleótidos según la reivindicación 8, en una reacción de amplificación enzimática para detectar e identificar la presencia de Peronospora arborescens en una muestra biológica.

10. Empleo según la reivindicación 9, en el que dicha muestra biológica es (i) una muestra de material vegetal, o (ii) una muestra de estructuras de P. arborescens.

11. Empleo según la reivindicación 10, en el que dicha muestra de material vegetal se selecciona entre tejidos de semillas, cubiertas de semillas, hojas, tallos, cápsulas, raíces y mezclas de las mismas.

12. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicha muestra biológica está infectada por P. arborescens.

13. Empleo según la reivindicación 10, en el que la muestra de estructuras de P. arborescens contiene micelio, esporangios, esporangióforos u oosporas.

14. Un kit para la identificación y detección de Peronospora arborescens que comprende, al menos, una pareja de oligonucleótidos según la reivindicación 8.