METODO PARA LA DETECCION Y CUANTIFICACION SELECTIVA DE ACIDO DOMOICO MEDIANTE SUS EFECTOS TOXICOS SOBRE CELULAS EXCITABLES.

Método para la detección y cuantificación selectiva de ácido domoico mediante sus efectos tóxicos sobre células excitables.

La presente invención se refiere a un método para la detección y cuantificación sistemática de la presencia de ácido domoico (DOM) en muestras problema, como extractos de alimentos marinos o muestras de aguas, mediante la utilización de células excitables en un medio extracelular con el ión sodio total o parcialmente sustituido. La exposición de los cultivos de células excitables a DOM en un medio como el mencionado, da lugar a una disminución de la viabilidad celular superior a la observada en presencia de ión sodio, mientras que el pretratamiento con un inhibidor de los receptores activados por DOM inhibidor dicho efecto tóxico. Con este método, es posible determinar la presencia de concentraciones de DOM en la muestra problema que no serian detectables en presencia de ión sodio en el medio extracelular

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200901255.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE OVIEDO.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: ASTURIAS.

Inventor/es: NOVELLI CIOTTI, ANTONELLO, PEREZ GOMEZ,ANABEL, FERNANDEZ SANCHEZ,M. TERESA.

Fecha de Solicitud: 13 de Mayo de 2009.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 21 de Mayo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N5/06B8A
  • G01N33/12 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Carne; Pescado.

Clasificación PCT:

  • C12N5/07 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células o tejidos animales.
  • G01N33/12 G01N 33/00 […] › Carne; Pescado.

Fragmento de la descripción:

Método para la detección y cuantificación selectiva de ácido domoico mediante sus efectos tóxicos sobre células excitables.

La presente invención se refiere a un método para la detección y cuantificación sistemática de la presencia de ácido domoico (DOM) en muestras problema, como extractos de alimentos marinos o muestras de aguas, mediante la utilización de células excitables en un medio extracelular con el ión sodio total o parcialmente sustituido.

La invención resulta de aplicación en aquellos sectores que precisen de la detección, identificación y cuantificación de sustancias químicas y bioquímicas de carácter tóxico en seres vivos, como por ejemplo en los sectores medioambiental o agroalimentario, y en particular en el campo de la seguridad alimentaria de productos marinos.

Estado de la técnica

El DOM es una potente neurotoxina producida por el alga diatomea Pseudo-nitzschia y acumulada por moluscos y otros animales marinos de habitual consumo sin que se aprecien cambios en su morfología o viabilidad. El DOM es un ácido tricarboxílico que interacciona con los receptores ionotrópicos no-NMDA (ácido N-metil-D-aspártico) del glutamato. Pertenece al grupo de las denominadas toxinas de tipo amnésico (ASP) y su ingestión mediante alimentos contaminados da lugar a intoxicaciones que en los casos más severos provocan daños cerebrales irreversibles. Por esta razón se hace necesario el desarrollo de métodos rápidos y específicos para su detección y cuantificación.

Existen varios métodos para determinar la presencia de DOM, entre los que se encuentra el bioensayo en ratón. Dicho método es universalmente aceptado para la detección de toxinas (Yasumoto T., Oshima Y., Sugawara M., Fukuyo Y., Oguri H., Igarashi T., Fujita N. (1980) Bull Japan Soc Sci Fish. 46: 1405-1411) y se basa en la observación de los efectos producidos tras la inyección intraperitoneal de extractos de hepatopáncreas de moluscos en ratones. Este bioensayo es de sencilla realización y ha resultado de gran utilidad para determinar si el producto es apto o no para el consumo humano. Sin embargo, cuenta con grandes inconvenientes:

- Económicos: Es un procedimiento costoso.
- Baja sensibilidad: los resultados obtenidos llevan implícito un gran margen de error.
- Falta de especificidad: no permite obtener información precisa de la naturaleza del agente tóxico.
- Elevada variabilidad: los resultados obtenidos pueden variar para el mismo extracto de marisco contaminado.
- Éticos: requiere el empleo masivo de animales de laboratorio.

Así, para la detección de rutina de las toxinas ASP, el método de bioensayo en ratón ha sido sustituido por métodos de cromatografía líquida con detector fluorométrico (James K.J., Gilhnan M., Lehane M., Gago-Martinez A. (2000) J Chromatogr A, 871:1-6) que resultan herramientas más sensibles y selectivas. Sin embargo, tanto este método como otros procedimientos de tipo analítico-químico (Zhao J.Y., Thibault P., Quilliam M.A. (1997) Electrophoresis 18:268-276; Thibault P., Quilliam M.A., Jamieson W.D., Boyd R.K. (1989) Biomed Environ Mass Spectrom 18: 373-386) requieren de un equipamiento costoso, complejo, de muestras muy elaboradas y, en muchos de los casos, de personal especializado. Además, sólo permiten cuantificar análogos de los que estén disponibles patrones purificados, lo cual no siempre está asegurado.

Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISAs) (Garthwaite I., Ross K.M., Miles C.O., Hansen R.P., Foster D., Wilkins A.L., Towers N.R. (1998) Nat Toxins 6:93-104) aunque son sensibles y relativamente rápidos en la detección, no discriminan entre isómeros biológicamente activos y no activos. Además, existen análogos de las toxinas que no son reconocidos por los anticuerpos o tienen una afinidad por el receptor muy baja para ser detectados con los ensayos de unión al receptor (London E.D., Coyle J.T. (1979) Molec Pharmacol. 15: 492-505), pero que si pueden ser evaluados por su actividad funcional. De esta manera se han desarrollado bioensayos celulares "in vitro" para la detección y cuantificación del DOM como la técnicas electrofisiológicas en preparaciones de rodajas de hipocampo de rata (Kerr D.S., Briggs D.M., Saba H.I. (1999) Toxicon. 37:1803-1825) pero cuentan con el problema de que no son capaces de detectar la presencia de varios compuestos en la muestra de estudio. Se han desarrollado también métodos citotóxicos, como el bioensayo para toxinas paralíticas y amnésicas basado en la detección fluorimétrica del aumento de la concentración de calcio intracelular en cultivos primarios corticales de rata (Beani L., Bianchi C., Guerrini F., Marani L., Pistocchi R., Tomasini M.C., Ceredi A., Milandri A., Poletti R., Boni L. (2000) Toxicon. 38: 1283-1297), para el que se requieren aparatos para la estimulación eléctrica celular. Otro método basado en la detección de neurotoxicidad es el bioensayo para la detección de ácido okadaico y DOM en cultivos primarios de cerebelo de rata en cultivo primario (Pat. no. ES2047403), para el que sólo se requiere microscopfa de epifluorescencia. Sin embargo, el método no es excesivamente sensible, siendo su límite de detección de 5 µM de DOM; además, se requieren 24 h de incubación con la muestra problema para cuantificar la toxina.

Descripción de la invención

El método propuesto en el presente documento se basa en que la exposición de los cultivos de células excitables a DOM en un medio extracelular con el ión sodio total o parcialmente sustituido, da lugar a una disminución de su viabilidad superior a la observada en presencia de ión sodio, mientras que el pretratamiento con un inhibidor de los receptores activados por DOM inhibe dicho efecto tóxico. Con este método, es posible determinar la presencia de concentraciones de DOM en la muestra problema que no serían detectables en presencia de ión sodio en el medio extracelular.

La presente invención se refiere a un método para la detección y cuantificación selectiva de DOM en células excitables, que comprende las siguientes etapas:

a) Establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de distintas concentraciones de DOM a un primer grupo de células excitables en un medio extracelular con el ión sodio total o parcialmente sustituido.
b) Establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de diluciones seriadas de la muestra problema a un segundo grupo de células excitables en un medio extracelular con el ión sodio total o parcialmente sustituido. A efectos de la presente invención, una muestra problema se refiere a extractos de alimentos o muestras de aguas en los que se quiere detectar la presencia de DOM.
c) Establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de diluciones seriadas de la muestra problema a un tercer grupo de células excitables en un medio extracelular con el ión sodio total o parcialmente sustituido y tratadas con una concentración efectiva de un inhibidor de los receptores activados por DOM.
d) Detección de los efectos citotóxicos inducidos en cada grupo de células y cuantificación de los niveles de viabilidad celular mediante el uso de protocolos o métodos efectivos para estos propósitos.
e) Comparación de los niveles de viabilidad entre los diferentes grupos de células para identificar al DOM como el agente causante de citotoxicidad y determinar su concentración en la muestra problema.

En una realización preferida el ión sodio extracelular se sustituye mediante la reducción o eliminación del cloruro sódico extracelular y la adición de una concentración equivalente a la eliminada de cloruro de colina. En una realización más preferida el cloruro sódico extracelular se sustituye entre 10 y 30 min antes de la adición de la toxina o el bloqueante.

En otra realización preferida, el inhibidor de los receptores activados por DOM es 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX).

En otra realización preferida, el inhibidor de los receptores activados por DOM es un inhibidor de los receptores no-NMDA de tipo AMPA (ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol-propiónico).

En una realización más preferida, el inhibidor de los receptores activados por DOM es 1-(4-aminofenil)-4-metil-7,8-metilendioxi-5H-2,3-benzodiacepina...

 


Reivindicaciones:

1. Método para la detección y cuantificación selectiva de DOM en células excitables, que comprende las siguientes etapas:

a) establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de distintas concentraciones de DOM a un primer grupo de células excitables en un medio extracelular con el ión sodio total o parcialmente sustituido;
b) establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de diluciones seriadas de la muestra problema a un segundo grupo de células excitables en un medio extracelular con el ión sodio total o parcialmente sustituido;
c) establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de diluciones seriadas de la muestra problema a un tercer grupo de células excitables en un medio extracelular con el ión sodio total o parcialmente sustituido y tratadas con una concentración efectiva de un inhibidor de los receptores activados por DOM;
d) detección de los efectos citotóxicos inducidos en cada grupo de células y cuantificación de los niveles de viabilidad celular mediante el uso de protocolos o métodos efectivos para estos propósitos;
e) comparación de los niveles de viabilidad entre los diferentes grupos de células para identificar al DOM como el agente causante de citotoxicidad y determinar su concentración en la muestra problema.

2. Método, según reivindicación 1, caracterizado porque el ión sodio extracelular se sustituye mediante la reducción o eliminación del cloruro sódico extracelular y la adición de una concentración equivalente a la eliminada de cloruro de colina.

3. Método, según reivindicación 2, caracterizado porque el cloruro sódico extracelular se sustituye entre 10 y 30 min antes de la adición de la toxina o el bloqueante.

4. Método, según reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de los receptores activados por DOM es CNQX.


 

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