Método de detección y cuantificación de las razas patogénicas del hongo Fusarium oxysporum f.

sp. ciceris.

La presente invención proporciona un método, basado en PCR convencional o cuantitativa en tiempo real (qPCR), fiable, rápido, exacto y reproducible para la detección y cuantificación de cualesquiera de las ocho razas patogénicas del hongo Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (0, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5 ó 6) en una muestra biológica aislada. Dicho método permite la detección y cuantificación de, como mínimo, 1 pg de ADN del patógeno en muestras biológicas complejas incluyendo diferentes tejidos de la planta de garbanzo y suelos infestados, sin que su exactitud y eficacia se vea alterada. La invención también se refiere a dos parejas de cebadores útiles para llevar a cabo el método de la invención.

Método de detección y cuantificación de las razas patogénicas del hongo Fusarium oxysporum f. sp. ciceris La presente invención se encuadra en el campo de la biología molecular y la agricultura, específicamente dentro de los métodos basados en PCR para la detección y cuantificación de las razas patogénicas del hongo Fusaríum oxysporum f. sp. cícerís en muestras biológicas aisladas de plantas de garbanzo y en suelo.

1 O ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El garbanzo (Cícer aríetínum L.) es una fuente importante de alimentación humana y animal, y ayuda a incrementar la fertilidad del suelo, especialmente en zonas áridas y tropicales semiáridas donde se concentra su producción. 15 Está descrito como el tercer cultivo de leguminosas en importancia en el mundo después de la judía (Phaseolus vulgarís L.) y el guisante (Písum satívum L.) . La Fusariosis Vascular del garbanzo, causada por F. oxysporum Schlechtend. emend W. C. Sny der. & H. N. Hans. f. sp. cícerís (Padwick) W. C. Sny der & H.

N. Hans., es la enfermedad más importante de las originadas por patógenos que habitan en el suelo que limita la producción de garbanzo en todo el mundo, pero principalmente en la cuenca mediterránea y el subcontinente indio. Las pérdidas anuales de rendimiento por esta enfermedad se han estimado entre el 10 Y el 15%, pero las epidemias de Fusariosis Vascular pueden ser devastadoras causando pérdidas del 100% en condiciones favorables. En particular, los ataques de la enfermedad son devastadores si se producen bajo condiciones de cultivo de alta temperatura y estrés hídrico durante las fases de reproducción y llenado de semilla.

F. oxysporum f. sp. cícerís muestra una alta variabilidad patogénica. Hasta la fecha se han descrito ocho razas patogénicas en F. oxysporum f. sp. cícerís (razas O, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5 Y 6) (Cabrera de la Colina et al., 1985, Int. Chíckpea Newsl., 13:24-26; Haware y Nene, 1982, Plant Oísease, 66: 809-810;

3d

Jiménez-Díaz et al., 1993, Proc. Eur. Sem. Fusaríum Mycotoxíns, Taxonomy, Pathogenícíty and Host Resístance, Radzíkóv, Poland: Plant Breedíng and Acclímatízatíon Instítute, pp 87-94) , las cuales pueden ser agrupadas dentro de los patotipos de marchitez y amarillez basándose en los síntomas que inducen en ensayos de patogenicidad. El patotipo de amarillez induce un progresivo amarillamiento foliar con decoloración vascular, seguida por la muerte de la planta en los 40 días después de la inoculación. El patotipo de marchitez induce clorosis severa y flacidez, decoloración vascular y muerte de la planta en los 20 días después de la inoculación. Las razas O y 1 B/C pertenecen al patotipo de amarillez y se consideran menos virulentas en comparación con las razas 1 A Y 2 a 6 que pertenecen al patotipo de marchitez y son consideradas más virulentas. Las razas 2, 3 Y 4 sólo han sido descritas en la India, mientras que las razas O, 1 B/C, 5 Y 6 se encuentran principalmente en la cuenca mediterránea y en California. La raza 1 A ha sido descrita en la India, California, y la cuenca mediterránea.

La utilización de cultivares resistentes es una de las pocas medidas disponibles y la más eficaz para el manejo de la Fusariosis Vascular del garbanzo, sin embargo, su uso no se encuentra muy extendido debido a la presencia de características agronómicas indeseables en algunos de los cultivares desarrollados, y a la alta variabilidad patogénica existente en las poblaciones de F. oxysporum f. sp. cícerís que podría limitar la eficacia o el uso extensivo de la resistencia disponible. Se han identificado varias fuentes de resistencia razaespecífica a la Fusariosis Vascular y han sido utilizadas en varios programas de mejora de garbanzo, los cuáles han permitido desarrollar un número limitado de germoplasma de garbanzo con resistencia operativa frente a razas específicas de este patógeno. Aunque la caracterización de razas patogénicas de F. oxysporum f. sp. cícerís está bien establecida, la genética de la resistencia a cada una de estas razas no ha sido completamente aclarada aún. Por consiguiente, la caracterización adecuada de la resistencia de las líneas y cultivares de garbanzo a las razas específicas de F. oxysporum f. sp. cícerís es esencial para la utilización de la resistencia.

Mientras que los aislados de F. oxysporum f. sp. cícerís pueden ser identificados o asignados a razas mediante diferentes protocolos basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (García-Pedrajas et al., 1999, European Journal of Plant Pathology, 105:251-259; Jiménez-Gasco et al., 2001, European Journal of Plant Pathology, 107:237-248; Jiménez-Gasco y Jiménez-Díaz, 2003, Phytopathology, 93:200-209; Kelly et al., 1998, Physíologícal and Molecular Plant Pathology, 52:397-409; ES2193861 81) , la caracterización de las reacciones de resistencia en germoplasma de garbanzo depende de los tradicionales bioensayos de patogenicidad. Este método de caracterización de resistencia es sencillo conceptualmente pero costoso en tiempo (de 50 a 60 días) , instalaciones y recursos necesarios. Además, el desarrollo de la enfermedad durante la tipificación patogénica puede verse influido por varios factores (por ejemplo, la humedad del suelo y la densidad de inóculo del patógeno) , así como por la temperatura, la cuál se ha demostrado que puede influir en la expresión de resistencia o susceptibilidad de cultivares de garbanzo a la Fusariosis Vascular. En consecuencia, la falta de ajuste de estas fuentes de variabilidad puede llevar a la incorrecta identificación de razas de F. oxysporum f. sp. cícerís o a la apreciación errónea de resistencia en genotipos de garbanzo. Por lo tanto, son necesarios nuevos métodos para la identificación rápida, fiable y reproducible, y para la cuantificación, del patógeno en los tejidos vegetales, principalmente en el tallo, lo cuál sería una evidencia de infección vascular, y por consiguiente, podría facilitar la evaluación de la respuesta de resistencia completa de los genotipos de garbanzo a sus razas patogénicas. Por otra parte, también sería útil disponer de un método para cuantificar el inóculo del patógeno en el suelo y ayudar así en la elección de suelos libres o con bajos contenidos de inóculo del patógeno y el uso de semillas de garbanzo libres de éste. Los protocolos de PCR cuantitativa han permitido la cuantificación exacta e independiente de medios de cultivos de una variedad microorganismos asociados al suelo o a plantas, incluyendo patógenos de plantas de tejidos vegetales, semillas y suelos. En diversos estudios, en los que se ha utilizado una amplia colección de aislados de F. oxysporum f. sp. cícerís de todo el mundo, se han desarrollado metodologías de PCR basadas en la Amplificación Polimórfica al Azar del AON (RAPO) , así como en cebadores específicos, que permiten la caracterización de la forma specíalís cícerís de F. oxysporum, sus patotipos y algunas de las ocho razas descritas del patógeno (García-Pedrajas et al., 1999, European Journal of Plant Pathology, 105:251-259; Kelly et al., 1998, Physíologícal and Molecular Plant Pathology, 52:397-409; ES2193861 81; Jiménez-Gasco et al., 2001, European Journal of Plant Pathology, 107:237-248; Jiménez-Gasco y Jiménez-Oíaz, 2003, Phytopathology, 93:200209) . No obstante, aunque algunos de estos protocolos se han desarrollado para ser aplicados tanto en planta como en suelo (Kelly et al., 1998, Physíologícal and Molecular Plant Pathology, 52:397-409; ES2193861 81; García-Pedrajas et al., 1999, European Journal of Plant Pathology, 105:251259) , la principal limitación de éstos es que no permiten cuantificar el patógeno en el suelo o su nivel de infección en la planta. Solventar esta limitación sería particularmente útil para: (i) discriminar entre germoplasma de garbanzo resistente y susceptible en programas de mejora mediante la cuantificación de las infecciones sintomáticas y asintomáticas, (ii) correlacionar la cantidad de patógeno en los tejidos de plantas infectadas con el nivel posterior de desarrollo de la enfermedad (expresión de síntomas) en germoplasma resistente o tolerante y/o el uso posterior de otras medidas (biológicas, físicas o químicas) de control de la enfermedad, y (iii) la selección de suelos de cultivo con cantidades no detectables o mínimas del agente patogénico.

Por tanto, la disponibilidad de un protocolo para detectar y cuantificar cualesquiera de las ocho razas patogénicas de Fusaríum oxysporum f. sp. cícerís en el suelo y en tejido de garbanzo puede ser de gran importancia... [Seguir leyendo]

1. Método de detección y cuantificación de cualesquiera de las razas patogénicas del hongo Fusarium oxysporum f. sp. ciceris en una muestra biológica aislada que comprende:

a. extraer el ADN de una muestra biológica aislada,

b. poner en contacto el ADN extraído en el paso (a) con una mezcla de reacción que comprende una pareja de cebadores capaz de amplificar la SEO ID NO: 1 o la SEO ID NO: 2,

c. amplificar la SEO ID NO: 1 o la SEO ID NO: 2, y

d. detectar y/o cuantificar el producto de amplificación obtenido en el paso (c) .

2. Método según la reivindicación 1 donde la muestra biológica aislada del paso (a) procede de suelo o de una planta de garbanzo.

3. Método según la reivindicación 2 donde la muestra biológica aislada procedente de una planta de garbanzo procede de raíz o tallo.

4. Método según cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde los cebadores del paso (b) capaces de amplificar la SEO ID NO: 1 son los cebadores de secuencia nucleotídica SEO ID NO: 3 y SEO ID NO: 4.

5. Método según cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde los cebadores del paso (b) capaces de amplificar la SEO ID NO: 2 son los cebadores de secuencia nucleotídica SEO ID NO: 5 y SEO ID NO: 6.

6. Método según cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la amplificación del paso (c) se lleva a cabo mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

7. Método según cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde las razas

patogénicas del hongo Fusarium oxysporum f. sp. ciceris se seleccionan de la lista que comprende: O, 1 A, 1 B/C, 2, 3, 4, 5 ó 6.

8. Cebadores de secuencia nucleotídica SEO ID NO: 3 y SEO ID NO: 4.

9. Cebadores de secuencia nucleotídica SEO ID NO: 5 y SEO ID NO: 6.

10. Uso de los cebadores según cualesquiera de las reivindicaciones 8 ó 9 para la detección de cualesquiera de las razas patogénicas del hongo Fusarium oxysporum f. sp. ciceris.

11. Uso de los cebadores según cualesquiera de las reivindicaciones 8 ó 9 para la cuantificación de cualesquiera de las razas patogénicas del hongo Fusarium oxysporum f. sp. ciceris.

12. Uso de los cebadores según cualesquiera de las reivindicaciones 10 u 11 donde las razas patogénicas del hongo Fusarium oxysporum f. sp. ciceris se seleccionan de la lista que comprende: O, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5 ó 6.

13. Kit de detección y cuantificación de cualesquiera de las razas patogénicas del hongo Fusarium oxysporum f. sp. ciceris que comprende una pareja de cebadores capaz de amplificar la SEO ID NO: 1 y/o una pareja de cebadores capaz de amplificar la SEO ID NO: 2.

14. Kit según la reivindicación 13 donde los cebadores capaces de amplificar la SEO ID NO: 1 son los cebadores de secuencia nucleotídica SEO ID NO: 3 y SEO ID NO: 4.

15. Kit según cualesquiera de las reivindicaciones 13 ó 14 donde los cebadores capaces de amplificar la SEO ID NO: 2 son los cebadores de secuencia nucleotídica SEO ID NO: 5 y SEO ID NO: 6.

16. Uso del kit según cualesquiera de las reivindicaciones 13 a 15 para la detección y cuantificación de cualesquiera de las razas patogénicas del hongo Fusarium oxysporum f. sp. ciceris.

17. Uso del kit según la reivindicación 16 donde las razas patogénicas del hongo Fusarium oxysporum f. sp. ciceris se seleccionan de la lista que comprende: O, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5 ó 6.