Método para la detección y cuantificación múltiple y simultánea de patógenos mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real.

Un método para la detección y cuantificación múltiple y simultánea de cualquier combinación de Listeria sp,

Staphylococcus aureus,Campylobacter jejuni y/o Escherichia coli O157.-H7, en una o másmuestras de ensayo mediante reacción de amplificación múltiplexempleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiemporeal, los pasos del método son (a) extraer ADN presente en la muestra o muestras de ensayo; (b) preparar una mezcla de reacción específica para los patógenos a detectar y cuantificar, tal que lamezcla de reacción contiene los reactivos necesarios para la amplificación enzimática del ADN extraído e identificación de los patógenos a detectar y cuantificar; (c) amplificar, mediante reacción de amplificación múltiplex empleado PCR, la mezcla de reacción;y (d) determinar simultáneamente Ia presencia o ausencia y cuantificación de los patógenos en la muestra o muestras de ensayo; elmétodo tiene la particularidad de que (i) la mezcla de reacciónpara la amplificación enzimática del ADN cuenta juegos de pares de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1 ySEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ IDNO: 8, y SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, y sondas con secuencias oligonucleótidas identificadas como SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 12; (ii) Ia presencia o ausencia y cuantificación de dichos patógenos en cualquier combinación se determina por una señal fluorescente o emisión de fluorescencia especifica de cada patógeno.

Método para la detección y cuantificación múltiple y simultánea de patógenos mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

Campo técnico de la invención La presente invención se relaciona, en general, con la detección, identificación y cuantificación de bacterias patógenas, y particularmente a un método para la detección y cuantificación múltiple de cualquier combinación de patógenos, tales como Listeria spp., Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escherichia coli O157:H7, mediante reacción de amplificación múltiplex empleando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real.

Antecedentes de la invención En la actualidad, la detección de bacterias patógenas transmisibles por alimentos, tales como Listeria spp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y Escherichia coli O157:H7, constituye una tarea muy importante en el campo de la medicina y de la higiene pública y tiene mucho interés en la industria agroalimentaria, tanto para la productora como la distribuidora de productos alimenticios (materias primas y/o productos elaborados) , por lo que se han descrito diversos métodos para sus detección e identificación.

Una de las metodologías actuales, consideradas entre las más efectivas para la detección, identificación y cuantificación de patógenos, es aquella que se basa en técnicas moleculares, como lo es el método de reacción en cadena de la polimerasa, comúnmente conocido como PCR. El procedimiento PCR generalmente es considerado como la metodología más sensible y rápida empleada para detectar ácidos nucleicos de patógenos en una determinada muestra de ensayo en particular, y la podemos encontrar descrita dentro del estado de la técnica por Kar y B. Mullis et al. en la familia de patentes estadounidenses US-4, 683, 195, US-4, 683, 202, US-4, 800, 159, US4, 889, 818, US-4965188, US-5, 008, 182, US-5, 038, 852, US-5, 079, 352, US-5, 176, 995, US-5, 310, 652, US-5, 310, 893, US-5, 322, 770, US-5, 333, 675, US-5, 352, 600, US-5, 374, 553, US-5, 386, 022, US-5, 405, 774, US-5, 407, 800, US5, 418, 149, US-5, 420, 029 entre otras.

Para llevar a cabo la técnica PCR, básicamente se tiene que contar con al menos un par de oligonucleótidos para cada uno de los patógenos a identificar, tal que cada par de iniciadores comprenden una primera secuencia nucleotídica complementaria a una secuencia que linda con el extremo 5’ de una secuencia de ácido nucleico objetivo y una segunda secuencia nucleotídica complementaria a una secuencia que linda con el extremo 3’ de la secuencia de ácido nucleico objetivo. Las secuencias de nucleótidos deben tener cada par de iniciadores de oligonucleótidos que son específicos al patógeno a detectar, de tal manera que no reaccionen o se crucen con otros patógenos.

Al ser la técnica PCR un método sensible y rápido para detectar patógenos en forma individual, esta también se puede emplear para detectar simultáneamente múltiples patógenos presentes en una muestra. Sin embargo, emplear la metodología PCR para la detección simultanea de múltiples patógenos en una muestra tiene su problemática, pues su principal obstáculo radica en la reacción cruzada que se pueda presentar debido al empleo de múltiples secuencias de nucleótidos a fin de tener la amplificación preferencial de ciertas secuencias objetivo presentes en la muestra a expensas de otras secuencias objetivo también presentes.

Ejemplos de detección múltiple y simultanea de patógenos, empleando la metodología de PCR, son descritos por John W. Czajka en la publicación de solicitud de patente internacional WO-0314704, y por Linxian Wo y otros en la familia de patentes estadounidenses US-5, 612, 473, US-5, 738, 995, US-5, 753, 444, US-5, 756, 701 y US-5, 846, 783.

En la publicación de solicitud de patente internacional WO-0314704 se describe un método para detectar específica y simultáneamente especies patógenas de Campylobacter en una muestra de ensayo compleja. Las especies patógenas de Campylobacter a detectar pueden ser Campylobacter jejuni o Campylobacter coli. La muestra de ensayo compleja puede ser una muestra de alimento, agua o una matriz enriquecida de alimento. El método utiliza la amplificación por PCR con o sin un control positivo interno y pares apropiados de iniciadores. Múltiples especies pueden ser detectadas en dicha reacción.

En la familia de patentes estadounidenses US-5, 612, 473, US-5, 738, 995, US-5, 753, 444, US-5, 756, 701 y US5, 846, 783 se describe un método de PCR múltiplex para detectar rápida y simultáneamente agentes infecciosos en una muestra. Los agentes infecciosos detectados son Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp., Yersinia spp. y Escherichia coli, en particular Escherichia coli O157:H7. La limitación del método descrito en estas patentes es que permite una reacción cruzada mínima entre los oligonucleótidos y sondas, así como de estos primeros con otras secuencias de ácido nucleico durante la amplificación.

La solicitud de patente FR-A-2844522, a su vez, describe un método para la amplificación simultánea de bacteria en el que las especies son: Shigella spp. y/o Hafnia alvei y/o Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Yersinia enterocolitica y Campylobacter jejuni. La amplificación se lleva a cabo de forma espacialmente separada, no en el mismo tubo como una PCR múltiplex. Además, algunos iniciadores y sondas no son específicas de especie: por ejemplo, los iniciadores y sondas diseñados para E. coli también permiten la detección de Hafnia alvei, Shigella spp. y Yersinia enterocolitica, siendo necesarios ensayos adicionales posteriores a la PCR para identificar las bacterias presentes en la muestra.

Fukushima, H. et al. (“Duplex real-time SYBR green PCR assays for detection of 17 species of food or waterbone pathogens in stools” Journal of Clinical Microbiology, vol.41, no. 11, Noviembre 2003 (2003-11) , páginas 5134-5146) proporcionan una PCR múltiplex en tiempo real utilizando la tecnología del Light-Cycler (LC) donde se pueden analizar simultáneamente ocho genes patógenos o específicos de patógenos contenidos en agua o en alimentos, utilizando LC-PCR. La reacción de amplificación, detección de los productos de PCR y el análisis de su Tm se pueden llevar a cabo en un único tubo capilar. Las cepas bacterianas ensayadas incluyen, entre otras, Escherichia coli O157:H7, Campylobacter jejuni y Staphylococcus aureus, pero el ensayo no está diseñado para detectar Listeria spp. Una limitación de este protocolo es que requiere una etapa de enriquecimiento durante toda la noche para adquirir una sensibilidad adecuada para procesar muestras de heces con con menos de 104 bacterias patógenas, contenidas en agua o en alimentos, por gramo.

De otros métodos moleculares que se emplean actualmente, existen algunos comercializados para detectar patógenos en alimentos, unos mediante hibridación de ADN (Gene-Trak systems, Unipath) , que es muy sensible pero requiere de aproximadamente 50 horas, y otros mediante amplificación de ácidos nucleicos (BAX, Dupont y FOMS Probelia, Sanofi Diagnostic Pasteur) que requieren, al menos, 24 horas. Ninguno de dichos métodos proporciona resultados en el mismo día de la producción del alimento ni realizan una cuantificación de la contaminación patógena presente.

Otros métodos moleculares basados en hibridación, útiles para detectar microorganismos, proporcionan el uso de matrices (arrays) de ácidos nucleicos con el fin de estudiar el nivel de expresión de genes presentes en ciertas bacterias. En este sentido, el documento WO 2005/014857 enseña el uso de una sonda de hibridación que es común a varias cepas de Staphylococcus aureus, tales como CO, N315, MOO, EMRSA-16, MSSA-476 y 8325. La sonda se denomina en el documento Secuencia 276356 y tiene la secuencia 5´AGATGAGCTACCTTCAAGACCTTC 3´.

La solicitud de patente US2006/051769-A1 enseña secuencias de ácido nucleico que están dispuestas en forma de una matriz de sondas que se puede utilizar para medir la expresión de genes de al menos 20.000 genes de Escherichia coli y al menos 500 regiones intragénicas. El método para detectar Escherichia coli requiere el uso de la técnica de PCR anidada que tiene dos rondas separadas de PCR para alcanzar suficiente sensibilidad. En el documento US2006/051769-A1, entre otras, se menciona una sonda para detectar un gen de Escherichia coli cuyo número de identificación de secuencia en la solicitud es: 190038, sonda que tiene la secuencia de nucleótidos 5´GATAAACTCATCGAAACAAGGCCAG3´, y que tiene el número de acceso GSN:AFE63324 en la base de datos de EBI.

También es conocido... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección y cuantificación simultánea de Listeria spp., Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y Escherichia coli O157:H7, en una muestra de alimento o del medio ambiente, mediante reacción de amplificación múltiplex, empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, comprendiendo el método las etapas de:

a) extraer ADN presente en dicha muestra de alimento o del medio ambiente; b) preparar una mezcla de reacción que incluye dicho ADN extraído, así como también

i) un par de oligonucleótidos iniciadores para la amplificación de cada secuencia diana de ácido nucleico y una sonda complementaria a dicha secuencia diana de ácido nucleico para cada uno de los patógenos a identificar, en donde el par de oligonucleótidos iniciadores y las sondas son:

un primer par de oligonucleótidos iniciadores identificados como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y una sonda identificada como SEQ ID NO: 3 para Listeria spp., un segundo par de oligonucleótidos iniciadores identificados como SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 6 para Staphylococcus aureus, un tercer par de oligonucleótidos iniciadores identificados como SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 9 para Campylobacter jejuni, un cuarto par de oligonucleótidos iniciadores identificados como SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 12 para Escherichia coli O157:H7,

en donde dichas pruebas están marcadas en su extremo 5’ con un fluoróforo y en su extremo 3’ con un apagador o un colorante capaz de capturar la energía emitida por la excitación del fluoróforo, y, ii) cuatro desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) seleccionados del grupo que consiste en adenosina

desoxinucleótido trifosfato (dATP) , guanosina desoxinucleótido trifosfato (dGTP) , timidina desoxinucleótido trifosfato (dTTP) , citosina desoxinucleótido trifosfato (dCTP) y nucleótidos análogos de los mismos;

c) proporcionar una polimerasa termoestable de ADN y una sal magnésica;

d) amplificar, mediante reacción de PCR, la primera secuencia diana de ácido nucleico de Listeria spp, la segunda secuencia diana de ácido nucleico de Staphylococcus aureus, la tercera secuencia diana de ácido nucleico de Campylobacter jejuni, y la cuarta secuencia diana de ácido nucleico de Escherichia coli O157:H7; y

e) tras la amplificación, determinar la presencia o ausencia de la primera, segunda, tercera y cuarta secuencia diana de ácido nucleico en los productos de PCR amplificados mediante una señal fluorescente o emisión de fluorescencia específica para cada ácido nucleico diana, para asimismo detectar y cuantificar simultáneamente Listeria spp., Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y Escherichia coli O157:H7, respectivamente, en la muestra de alimento o del medio ambiente.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha mezcla de reacción comprende:

200 pmol del iniciador de SEQ ID NO: 1; 200 pmol del iniciador de SEQ ID NO: 2; 50 pmol de la sonda de SEQ ID NO: 3; 200 pmol del iniciador de SEQ ID NO: 4; 200 pmol del iniciador de SEQ ID NO: 5; 50 pmol de la sonda de SEQ ID NO: 6; 300 pmol del iniciador de SEQ ID NO: 7; 200 pmol del iniciador de SEQ ID NO: 8; 350 pmol de la sonda de SEQ ID NO: 9; 200 pmol del iniciador "corriente arriba" de SEQ ID NO: 10; 200 pmol del iniciador "corriente abajo" de SEQ ID NO: 11; 50 pmol de la sonda de SEQ ID NO: 12; 200 µmol de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) ; 3, 5 µl de sal magnésica; y 5 µl de ADN extraído de dicha muestra de alimento o del medio ambiente.

3. El método de la reivindicación 1, en el que, para la sonda de SEQ ID NO: 3, el fluoróforo para su extremo 5’ es TET y el colorante para su extremo 3’ es BHQ-1.

4. El método de la reivindicación 1, en el que, para la sonda de SEQ ID NO: 6, el fluoróforo para su extremo 5’ es TxR y el colorante para su extremo 3’ es BHQ-2.

5. El método de la reivindicación 1, en el que, para la sonda de SEQ ID NO: 9, el fluoróforo para su extremo 5’ es Cy5 y el colorante para su extremo 3’ es BHQ-3.

6. El método de la reivindicación 1, en el que, para la sonda de SEQ ID NO: 12, el fluoróforo para su extremo 5’ es FAM y el colorante para su extremo 3’ es BHQ-1.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la polimerasa termostable de ADN es Taq.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la sal magnésica es cloruro magnésico.

9. Un kit de diagnóstico para la detección y cuantificación simultánea de Listeria spp., Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y Escherichia coli O157:H7, en una muestra de alimento o del medio ambiente, mediante reacción de amplificación múltiplex, empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, kit de diagnóstico que comprende:

un primer par de oligonucleótidos iniciadores que consiste en un iniciador “corriente arriba” de SEQ ID NO: 1 y un iniciador “corriente abajo” de SEQ ID NO: 2; un segundo par de oligonucleótidos iniciadores que consiste en un iniciador “corriente arriba” de SEQ ID NO: 4 y un iniciador “corriente abajo” de SEQ ID NO: 5; un tercer par de oligonucleótidos iniciadores que consiste en un iniciador “corriente arriba” de SEQ ID NO: 7 y un iniciador “corriente abajo” de SEQ ID NO: 8; un cuarto par de oligonucleótidos iniciadores que consiste en un iniciador “corriente arriba” de SEQ ID NO: 10 y un iniciador “corriente abajo” de SEQ ID NO: 11; una sonda de SEQ ID NO: 3, que está marcada en su extremo 5’ con TET y en su extremo 3’ con BHQ-1; una sonda de SEQ ID NO: 6, que está marcada en su extremo 5’ con TxR y en su extremo 3’ con BHQ-2; una sonda de SEQ ID NO: 9, que está marcada en su extremo 5’ con Cy5 y en su extremo 3’ con BHQ-3; una sonda de SEQ ID NO: 12, que está marcada en su extremo 5’ con FAM y en su extremo 3’ con BHQ-1; cuatro desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) seleccionados del grupo que consiste en adenosina desoxinucleótido trifosfato (dATP) , guanosina desoxinucleótido trifosfato (dGTP) , timidina desoxinucleótido trifosfato (dTTP) , citosina desoxinucleótido trifosfato (dCTP) y nucleótidos análogos de los mismos; polimerasa termoestable de ADN; y cloruro magnésico.

FLUORESCENCIA

A3

110 A2 A4

A1

A3

A1 A2

A4 -10

- 10 20 30 40 CICLOS

FIG. 1

FLUORESCENCIA

A2 A1 A3

A1 A2 A3 30

A4

-

- 10 20 30 40 CICLOS

FIG. 2

FLUORESCENCIA

A1 30

A2

-

- 10 20 30 40 CICLOS

FIG. 3

CICLOS

FIG. 4