MÉTODO DE OBTENCIÓN DE UN BIOMATERIAL.

Método de obtención de un biomaterial.

La presente invención está dirigida a un método de obtención de un biomaterial que comprende un soporte de fibras de carbón activado y células de linaje osteocondral,

en el que células madre se ponen en contacto con dicho soporte y se cultivan en presencia de suero y ausencia de factores de diferenciación osteogénica y/o condrogénica adicionales. La invención se dirige asimismo al biomaterial así obtenido y a las diferentes aplicaciones médicas de dicho biomaterial.

MÉTODO DE OBTENCiÓN DE UN BIOMATERIAL

OBJETO DE LA INVENCiÓN

La presente invención está relacionada con una metodología para la obtención de un biomaterial que comprende un soporte de fibras de carbón activado, células de linaje osteocondral y matriz extracelular, en donde las células de linaje osteocondral proceden de la diferenciación de células madre en contacto con el soporte de fibras de carbón activado en presencia de un medio de cultivo que comprende suero y que no comprende factores de diferenciación de células madre ni adicionales ni diferentes a los presentes en el suero. La presente invención se relaciona asimismo con el biomaterial directamente obtenido mediante dicha metodología, así como con los usos médicos de dicho biomaterial.

ANTECEDENTES DE LA INVEN CIÓN

El desarrollo de la ingeniería tisular está orientado en la actualidad a la búsqueda de nuevos biomateriales que permitan, entre otros, la obtención de líneas celulares con capacidad de proliferación y de diferenciación a diversos tejidos.

La estructura tridimensional de los diferentes biomateriales proporciona un soporte (scaffold) adecuado para la adherencia, proliferación y diferenciación celular en condiciones de cultivo adecuadas.

El medio de cultivo habitualmente empleado en la diferenciación de células madre mesenquimales en osteocitos comprende factores tales como dexametasona, ¡3glicerofosfato o ácido ascórbico, mientras que el medio habitualmente empleado en el caso de diferenciación de dichas células madre en condrocitos comprende factores tales como dexametasona, ácido ascórbico, insulina, transferrina o selenio.

Las condiciones de diferenciación de células madre en osteocitos y en condrocitos son conocidas. Adicionalmente, se ha descrito que células madre mesenquimales en cultivo en un medio condicionado condrocítico dan lugar a la formación de cartílago , y que los factores secretados por los condrocitos promueven tanto la condrogénesis como la osteogénesis (Hwang NS el al. 2010 J Cell Physiol 212 (2) : 281-284) . También se ha descrito la

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composición de un medio mínimo para la diferenciación osteocondrocítica (U J et al. 2009 Tissue Eng Part A 15 (9) : 2481-2490) .

Es conocido del estado de la técnica el empleo de diferentes soportes para la diferenciación de células madre mesenquimales, tales como soportes de ácido poliglicólico (PGA) o de ácido poli-L-Iáclico (PLLA) (Zhao L & Delamore MS 2010 J Biomed Sci Eng 3: 1041-1049) , soportes basados en geles de fibrina y poli-Iacto-co-caprolactona (PLCL) (Jung Y et al. 2009 Biomed Mater 4: 1-7) , soportes basados en una matriz tridimensional derivada de ácido hialurónico, una matriz tridimensional de material cerámico e ingredientes activos ('NO 02/070030) , soportes basados en policaprolactona (Cao T et al. 2003 Tissue Eng 9 (1) : Sl 03-S112, Shao X el al. 2006 Tissue Eng 12 (6) : 1539-1551) , soportes cerámicos porosos de fosfato cálcico (Gao J el al. 2001 Tissue Eng 7 (4) : 363-371) , y soportes de nanofibras (Hu J el al. 2009 Biomaterials 30 (28) : 5061-5067) . También se han usado carbones activados en polvo y en forma granular procedentes de un carbón bituminoso y de cáscara de coco, respectivamente, como soportes en la diferenciación de células de linaje neuronal (Chen E el al. 2012 J Biomed Mater Res A 100 (8) : 2006-2017) .

Se ha descrito anteriormente el empleo de telas de carbón activado como soporte para el crecimiento de células madre mesenquimales y su diferenciación a osteocitos en condiciones de diferenciación osteocítica (Peñalver JL et al. 2009 Carbon 47: 3574-3584) , o a condrocitos en condiciones de diferenciación condrogénica (V. de Araujo Farias et al. 2011 Boletín del Grupo Español del Carbón 22: 7-13) .

Composiciones celulares para implante que comprenden osteocitos y condrocitos sobre un soporte tridimensional tapizado con colágeno han sido descritas en la técnica (US2011 /0274729 A 1) .

A la vista del estado de la técnica, es de interés proporcionar metodologías de diferenciación celular basadas en soportes tridimensionales que permitan la diferenciación de células madre en diversos tipos celulares, tales como los implicados en regeneración ósea, osteogénesis y condrogénesis, en condiciones de cultivo adecuadas que permitan la diferenciación simultánea de dichos tipos celulares, ventajosamente en un mismo tipo de soporte y sin requerimiento de múltiples manipulaciones del cultivo.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

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Los autores de la presente invención han desarrollado una metodología de diferenciación de células madre sobre un soporte tridimensional que permite la obtención de tipos celulares implicados en regeneración ósea en condiciones de cultivo celular que no requieren factores de diferenciación adicionales y/o diferentes a los presentes en el suero del cultivo celular.

Así, la presente invención está dirigida a un biomaterial que comprende un soporte de fibras de carbón activado, células de linaje osteocondral y matriz extracelular, así como a un método de obtención de dicho biomaterial ya los usos del mismo.

Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un método de obtención de un 10 biomaterial que comprende un soporte de fibras de carbón activado, células de linaje osteocondral y matriz extra celular, en donde dicho método comprende (i) poner en contacto el soporte de fibras de carbón activado con células madre en condiciones adecuadas de adhesión celular de las células madre sobre el soporte de fibras de carbón activado, y

(ii) mantener el cultivo celular obtenido en la etapa (i) en presencia de un medio de cultivo adecuado y durante el tiempo suficiente para la diferenciación de las células madre en células de linaje osteocondral y la formación de una matriz extracelular, en donde dicho medio de cultivo comprende suero adecuado para el cultivo celular y en donde dicho medio de cultivo no ha sido suplementado con al

menos un factor adecuado para la diferenciación de células madre a células de linaje osteocondral adicionales y/o diferentes a los presentes en el suero.

En un segundo aspecto, la invención se relaciona con el biomaterial obtenible mediante el método indicado anteriormente.

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con el uso del biomaterial obtenible mediante el método indicado anteriormente para preparar un medicamento.

En un último aspecto, la invención se relaciona con el uso del biomaterial obtenible mediante el método indicado anteriormente para preparar un medicamento para el tratamiento de una patología ósea, de una patología condrogénica, de una patología que cursa con una lesión condral, de una patología que cursa con una lesión ósea o de una patología que cursa con una lesión osteocondral.

DESCRIPCiÓN DE LOS DIBUJOS

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Estas y otras características y ventajas de la invención, se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la descripción detallada que sigue de una forma preferida de realización, dada únicamente a título de ejemplo ilustrativo y no limitativo, con referencia a las figuras que se acompañan.

Figura 1. (A) Micrografia SEM de la tela de carbón activado (TeA) . (B) Isoterma de adsorción-desorción N2 a -196 o C; adsorción (triángulos negros) , desorción (triángulos de color gris) .

Figura 2. Cinética de crecimiento de células madre mesenquimales humanas derivadas del estroma del cordón umbilical (UCSSC) cultivadas sobre tela de carbón activado (TCA) . (A) Histograma de la cantidad de núcleos contados en función del tiempo de cultivo. Obsérvese que desde 3 a 17 días hay un aumento progresivo en el número de células. La disminución en el número de células que se ve a los 21 días está asociada con el pico en la intensidad de la señal autofluorescente. (B) Regresión lineal de los datos correspondientes a la fase de crecimiento inicial. El tiempo de duplicación de las células en esta fase era T D = 88 ± 15 horas, R' = 0.987 (P <0, 001) .

Figura 3. Cinética de crecimiento de UCSSCs cultivadas sobre TCA en medio de diferenciación específico de osteocitos y condrocitos. Los datos se representan como barras para cada tiempo de cultivo. (A) Histograma del proceso de crecimiento y diferenciación inducida hacia osteocitos. (B) Histograma de la cinética de crecimiento de células en medio de diferenciación condrocítica. Las diferencias entre cada una de las columnas se calcularon por ANOVA, aplicando después el test de Bonferroni. Cuando las diferencias son estadísticamente significativas se señalan en el gráfico (***... [Seguir leyendo]

1. Método de obtención de un biomaterial que comprende un soporte de fibras de carbón activado, células de linaje osteocondral y matriz extracelular, en donde dicho método comprende

(i) poner en contacto el soporte de fibras de carbón activado con células madre en condiciones estándar de adhesión celular de las células madre sobre el soporte de fibras de carbón activado, y

(ii) mantener el cultivo celular obtenido en la etapa (i) en presencia de un medio de cultivo para el cultivo celular de células madre y durante el tiempo suficiente para la diferenciación de las células madre en células de linaje osteocondral y la formación de una matriz extracelular, en donde dicho medio de cultivo comprende suero para el cultivo celular y en donde dicho medio de cultivo no ha sido suplementado con ningún factor para la diferenciación de células madre a células de linaje osteocondral adicional o diferente a los presentes en el suero

en donde las células madre no son células madre obtenidas por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima.

2. Método según la reivindicación 1 en donde los poros del soporte de fibras de carbón activado son perpendiculares al eje de la fibra y están abiertos hacia la superficie de dicho soporte.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el soporte de fibras de carbón activado tiene un área superficial de al menos 1500 m2¡g.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el soporte de fibras de carbón activado tiene un volumen de microporos de entre el 70 y el 90% respecto al volumen total de los poros existentes.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde los microporos del soporte de fibras de carbón activado tienen una anchura media menor de 2 nm.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el pH del punto cero de carga de la superficie del soporte de fibras de carbón activado tiene un valor comprendido entre 6 y 9.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el soporte de fibras de carbón activado se selecciona del grupo que comprende telas de carbón activado, fieltros de carbón activado y cuerdas de carbón activado.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el factor para la diferenciación de células madre en células de linaje osteocondral se selecciona del grupo que comprende dexametasona, beta-glicerofosfato, ácido ascórbico, insulinatransferrina-selenito sódico (lTS) , TGF-betal , TGF-beta2, BMP, IGF-I, prolina, piruvato sódico, osteogenina y vitamina D.

9. Método según la reivindicación 8 en donde el medio de cultivo no ha sido suplementado con dexametasona, beta-glicerofosfato, ácido ascórbico e insulinatransferrina-selenito sódico (ITS) .

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el medio de cultivo es suplementado con aminoácidos no esenciales y/o bFGF.

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. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde las células de linaje osteocondral se seleccionan del grupo que comprende osteoblastos, osteocitos, condroblastos y condrocitos.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la matriz extra celular comprende colágeno.

13. Método según la reivindicación 12 en donde la matriz extracelular comprende, adicionalmente, osteopontina, hidroxiapatita, carbonato cálcico y/o carbonato magnésico.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde las células madre se cultivan en condiciones estándar de expansión celular previamente a su puesta en contacto con el soporte de fibras de carbón activado.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde las células madre son seleccionadas del grupo que comprende células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas o combinaciones de las mismas, en

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donde las células madre no son células madre obtenidas por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde las células madre son células madre mesenquimales.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde las células madre mesen quima les son obtenidas a partir de médula ósea, tejido adiposo, hígado, bazo, testículos, sangre menstrual, fluido amniótico, páncreas, periostio, membrana sinovial, músculo esquelético, dermis, pericitos, hueso trabecular, cordón umbilical, pulmón, pulpa dental y sangre periférica.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde las células madre mesenquimales son humanas.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde las células madre son células madre mesenquimales procedentes de cordón umbilical humano.

20. Biomaterial obtenible mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

. Uso de un biomaterial según la reivindicación 20 para preparar un medicamento.

22. Uso de un biomaterial según la reivindicación 20 para preparar un medicamento para el tratamiento de una patología ósea, de una patología condrogénica, de una patología que cursa con una lesión condral, de una patología que cursa con una lesión ósea o de una patología que cursa con una lesión osteocondral.

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