Método de eliminación de endotoxinas de proteínas.

Un método exento de tensioactivo de producción de un producto de lactoferrina exento de endotoxina mediante la eliminación de la endotoxina unida a una proteína en una composición líquida de lactoferrina

, comprendiendo el método las etapas de:

a) hacer pasar la composición líquida de lactoferrina que comprende una proteína con endotoxina unida a través de un sistema de intercambio catiónico usando distribución fractal para unir la proteína con la endotoxina unida a la resina de intercambio catiónico;

b) eluir la endotoxina de la proteína unida usando una solución salina 0,25-0,35 molar en ausencia de tensioactivo añadido; y

c) eluir la proteína unida con una solución salina que tiene una conductividad de entre 80 y 100 mS/cm para producir un producto de lactoferrina exento de endotoxina;

donde la proteína con la endotoxina unida se selecciona de una o más de lactoferrina, lactoferricina, lactoperoxidasa y apolactoferrina.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E13175557.

Solicitante: Glanbia Nutritionals (Ireland) Limited.

Nacionalidad solicitante: Irlanda.

Dirección: Glanbia House Kilkenny IRLANDA.

Inventor/es: WROBEL,STAN, THOMSON,KEVIN, WARD,LOREN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Procedimientos generales de preparación de péptidos > C07K1/18 (Cromatografía de intercambio iónico)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen péptidos... > A61K38/40 (Transferrinas, p. ej. lactoferrinas, ovotransferrinas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/79 (Transferrinas, p. ej. lactoferrinas, ovotransferrinas)

PDF original: ES-2518290_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método de eliminación de endotoxinas de proteínas La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/948839 presentada con anterioridad el 10 de julio de 2007.

Campo de la invención

La invención se refiere a métodos de eliminación de endotoxinas de proteínas. Más específicamente, la invención se refiere a métodos de eliminación de endotoxinas de las proteínas que se unen a la endotoxina y a productos generados mediante ese proceso.

Antecedentes de la invención

El término "endotoxina" se usa más comúnmente para referirse a un complejo de lipopolisacárido asociado con la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, aunque hay una variedad de microorganismos que tienen componentes "de tipo endotoxina". La endotoxina se asocia con una variedad de efectos negativos en las células y los tejidos, incluyendo el fomento de la muerte celular y la activación de las citocinas proinflamatorias y el óxido nítrico. A niveles suficientes en el organismo, la endotoxina puede producir un "choque tóxico", una afección con peligro para la vida. Nakagawa et al. (Nakagawa, Y. et al. "Endotoxin Contamination in Wound Dressings Made of Natural Biomaterials.â??, J. Biomed. Mater. Res. Part B: Appl. Biomater. 66B: 347-355, 2003) , demostraron que la contaminación por endotoxinas en nueve apósitos para heridas naturales diferentes pudo producir fiebre en conejos.

Se ha desarrollado una variedad de métodos para la eliminación de la endotoxina de las proteínas. Sin embargo, estos métodos, no se prestan a la producción de grandes cantidades de composiciones exentas de endotoxina. Durante años, la eliminación total de la endotoxina normalmente solo se lograba con la pérdida masiva de sustrato proteico durante el proceso. Más recientemente, se han desarrollado productos para aumentar la eliminación de la endotoxina con la recuperación significativa del sustrato proteico, pero, hasta la fecha, estos productos y los métodos en los que se basan no han sido adecuados para la producción de grandes cantidades de proteína exenta de endotoxina de una manera rentable. Algunos métodos, tales como el descrito por Naidu (patente de EE.UU. Nº 7.125.963) utilizan una metodología de múltiples etapas y múltiples reactivos para la eliminación de la endotoxina. Para algunos productos, es deseable limitar el uso de algunos de estos reactivos, tales como detergentes/tensioactivos, que pueden ser costosos cuando se usan en grandes cantidades. Así pues, un método de este tipo puede tener un coste prohibitivo para la preparación de algunos productos.

El documento WO95/22258A describe un método de purificación de lactoferrina humana usando una resina de intercambio catiónico.

La lactoferrina es una proteína multifuncional que pertenece a la familia de las proteínas transferrinas. Se trata de una proteína de 80 kDa, que se encuentra principalmente en la leche y en las secreciones mucosas. La lactoferrina se une al hierro, a la heparina, al proteoglucano, al ADN, a los oligodesoxinucleótidos y a los LPS (endotoxinas) . Se han identificado dos sitios de unión a los LPS en la lactoferrina, la región del bucle 28-34 y cuatro argininas Nterminales (restos 2-5) . Se ha demostrado la eficacia de la lactoferrina contra los efectos biológicos de las 45 endotoxinas. Sin embargo, la lactoferrina se une fácilmente a la endotoxina, y sería deseable eliminar la endotoxina unida y mejorar el beneficio global que la lactoferrina puede proporcionar. Además, sería beneficioso desarrollar métodos para eliminar la endotoxina de grandes cantidades de una variedad de diferentes proteínas, y especialmente de aquellas proteínas que se unen a la endotoxina.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un método según lo definido en las reivindicaciones. Lo descrito se refiere a un método de eliminación de la endotoxina de una proteína, comprendiendo el método la unión de la proteína a una resina de intercambio catiónico, eluyendo la endotoxina de la proteína unida con el uso de una solución de baja fuerza iónica 55 (es decir, baja concentración de sal) sin tensioactivo añadido, y eluyendo la proteína de la resina con el uso de una solución de alta fuerza iónica tal como una composición con alta concentración de sal, ácido u otras composiciones adecuadas. El método puede comprender además las etapas de filtrar la proteína eluida y secar el producto de la etapa de ultrafiltración. También se describe el uso de la distribución fractal para aplicar la proteína con la endotoxina unida, la solución de baja fuerza iónica y la solución de alta fuerza iónica a una columna de intercambio catiónico.

También se describe un método de eliminación de la endotoxina de lactoferrina, lactoferricina, lactoperoxidasa y/u otras proteínas unidas a la endotoxina, así como productos exentos de endotoxina, tales como lactoferrina exenta de endotoxina (LEE) , producidos mediante el método. Cuando se aísla de la leche o de una fracción de leche, dicho 65 producto también puede comprender factores adicionales derivados de la leche que tengan propiedades deseables tales como, por ejemplo, glucomacropéptido, factores de crecimiento u otras proteínas, lípidos, etc., y en particular

aquellos agentes derivados de la leche bovina que tienen actividad de unión a endotoxinas o actividad neutralizante de endotoxinas. También se describen composiciones que también pueden comprender LEE y xilitol, opcionalmente suplementados con una composición antimicrobiana que comprenda plata.

También se describen métodos de tratamiento de una herida aguda y de tratamiento de afecciones asociadas con las biopelículas, incluyendo heridas crónicas, que comprenden administrar una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un lactoferrina bovina derivada de la leche exenta de endotoxina. Los métodos también pueden comprender la administración de agentes activos adicionales tales como, por ejemplo, lactoferrina activada, xilitol, una composición antimicrobiana de plata o una combinación de los mismos.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 es un diagrama de flujo que describe una realización del presente método de eliminación de la endotoxina de una composición proteica.

La Fig. 2 es un gráfico de barras que ilustra los resultados de un ensayo XTT realizado tras una exposición de 24 horas a los productos de lactoferrina indicados en el eje x (medios + suero + producto) . La Fig. 3 es una fotografía de células expuestas a lactoferrina al 1 % con bajo contenido de endotoxina (izquierda) y a lactoferrina al 1 % con contenido medio de endotoxina (derecha) . Los medios contenían suero de ternera fetal.

La Fig. 4 es una fotografía de células expuestas a lactoferrina al 2 % con bajo contenido de endotoxina (izquierda) y a lactoferrina al 2 % con contenido medio de endotoxina (derecha) . Los medios contenían suero de ternera fetal. La Fig. 5 es una fotografía de células expuestas a lactoferrina al 3 % con bajo contenido de endotoxina (izquierda) y a lactoferrina al 3 % con contenido medio de endotoxina (derecha) . Los medios contenían suero de ternera fetal. La Fig. 6 es una fotografía de células tratadas como control (EpiLifeï¢ + suero de ternera fetal al 1 %, sin lactoferrina añadida) .

Descripción detallada

Los inventores han desarrollado un nuevo método de eliminación de la endotoxina de una proteína. El método no requiere el uso de detergentes/tensioactivos y, a diferencia de los métodos actualmente disponibles, es adecuado para la producción de cantidades en kilogramos de proteína exenta de endotoxina de una manera rentable. El método de la invención se puede usar... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método exento de tensioactivo de producción de un producto de lactoferrina exento de endotoxina mediante la eliminación de la endotoxina unida a una proteína en una composición líquida de lactoferrina, comprendiendo el 5 método las etapas de:

a) hacer pasar la composición líquida de lactoferrina que comprende una proteína con endotoxina unida a través de un sistema de intercambio catiónico usando distribución fractal para unir la proteína con la endotoxina unida a la resina de intercambio catiónico;

b) eluir la endotoxina de la proteína unida usando una solución salina 0, 25-0, 35 molar en ausencia de tensioactivo añadido; y c) eluir la proteína unida con una solución salina que tiene una conductividad de entre 80 y 100 mS/cm para producir un producto de lactoferrina exento de endotoxina;

donde la proteína con la endotoxina unida se selecciona de una o más de lactoferrina, lactoferricina, lactoperoxidasa y apolactoferrina.

2. Un método según lo reivindicado en la reivindicación 1, donde la proteína eluida comprende menos de 20

unidades de endotoxina por miligramo de proteína (UE/mg) . 20

3. Un método según lo reivindicado en la reivindicación 1 o 2, donde la proteína eluida comprende menos de 10 unidades de endotoxina por miligramo de proteína (UE/mg) .

4. Un método según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la proteína eluida comprende 25 menos de 1 unidad de endotoxina por miligramo de proteína (UE/mg) .

5. Un método según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la solución salina 0, 25-0, 35 molar tiene una conductividad de entre 28 y 37 mS/cm.

6. Un método según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la composición líquida de lactoferrina se obtiene de suero dulce de la leche, leche y/o fracciones lácteas.

7. Un método según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además la etapa de secar la proteína eluida. 35

8. Un método según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la composición de lactoferrina que se hace pasar a través del sistema de intercambio catiónico comprende más del 2 % de lactoferrina.