METODO DE DIAGNOSTICO DE CANCER COLORECTAL.

El objeto de la presente invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar cáncer colorectal basado en la determinación,

en una muestra biológica obtenida de un sujeto, del estado de metilación del promotor de al menos uno de los genes APC, RARB2 y p14 y, opcionalmente, MGMT y p16. Asimismo, es objeto de la presente invención un kit para llevar a cabo el método de la invención

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200803127.

Solicitante: FINA BIOTECH, S.L.U.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: MADRID.

Inventor/es: AZUARA GARCIA,DANIEL, CAPELLA MUNAR,GABRIEL, ESTELLER BADOSA,MANEL.

Fecha de Solicitud: 3 de Noviembre de 2008.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 21 de Julio de 2011.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68M6B

Clasificación PCT:

  • C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2346503_B1.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método de diagnóstico de cáncer colorectal.

Campo de la invención

La presente invención tiene su campo de aplicación dentro del sector sanitario, en el campo de la Biología Molecular. En concreto, esta invención está dirigida a un método de diagnóstico precoz de cáncer colorectal y a un kit para su desarrollo.

Antecedentes de la invención

El cáncer colorrectal (CCR) es la tercera forma más común del cáncer y la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en el mundo occidental. Su evolución natural (se cree que se produce una secuencia de adenoma-carcinoma en la mayoría de los pacientes) y accesibilidad mediante métodos no quirúrgicos lo hacen adecuado para la detección y prevención precoz.

La detección precoz mejora enormemente las posibilidades de cura. La colonoscopia es una prueba extremadamente específica y sensible que puede considerarse como el método de referencia para el diagnóstico precoz de CCR [44,45] y se recomienda habitualmente que se realice en intervalos de 10 años para la detección, comenzando normalmente a la edad de 50 años [1]. Sin embargo, es una prueba invasiva que requiere una buena preparación intestinal y voluntad del paciente. También está asociada con un pequeño riesgo de complicaciones significativas, lo que reduce su uso generalizado.

Se considera generalmente que la prueba de sangre oculta en heces (Fecal occult blood testing, FOBT) es la mejor prueba de detección no invasiva para CCR, ya que reduce la mortalidad relacionada con el cáncer cuando se usa de manera programada [2]. Sin embargo, su sensibilidad es bastante baja (15% para adenomas y 35% para carcinomas), lo que implica que una parte sustancial de neoplasias colorrectales pasan desapercibidas [1], Además, presenta una baja especificidad, dando lugar a muchos falsos positivos. Además, algunas pruebas requieren que los pacientes cambien su dieta, lo que reduce potencialmente su empleo [46-47].

En este contexto, las pruebas de ADN en muestras no invasivas aparecen como un enfoque viable que puede complementar y probablemente superar otras pruebas de detección para CCR [3-5] [23-26], aunque hasta el momento, su aplicación clínica rutinaria es todavía tema de discusión [6-7, 27].

El ADN parece ser estable en las heces, y aunque estén presentes inhibidores de PCR, las etapas de purificación han permitido de manera sistemática realizar análisis basados en PCR en una alta proporción de muestras [28-30]. Esta proporción es mayor cuando se diagnostican lesiones, especialmente carcinomas colorrectales. Las muestras de heces en sujetos con CCR pueden contener más células exfoliadas y/o ADN amplificable [31].

La mayoría de los estudios publicados hasta ahora usando el ADN de heces han detectado mutaciones en genes o marcadores individuales (p. ej., K-ras, p53, APC o BAT26) [16,26,32-33] con sensibilidad y especificidad aceptables, aunque variables. Otros han postulado el uso de un panel de ensayo de mutación de múltiples dianas que, en un gran entorno de detección, demostró una sensibilidad del 51,6% para carcinomas y del 32,5% para adenomas con displasia de grado alto [29], Estos resultados prometedores están asociados con una reducción moderada de la especificidad (95%), debido a la detección de mutaciones en cólones endoscópicamente normales.

La metilación de los residuos de citosina de secuencias ricas en dinucleótidos citosina-guanina (islas CpG), situadas dentro de las regiones promotoras de genes, normalmente está asociada con el silenciamiento génico y se considera como un mecanismo de inactivación de genes del cáncer.

Los genomas de las células preneoplásicas, cancerosas y envejecidas comparten tres cambios importantes en los niveles de metilación, como eventos tempranos en el desarrollo de algunos tumores. Primero, la hipometilacíón de la heterocromatina que conduce a una inestabilidad genómica e incrementa los eventos de recombinación mitótica; segundo, hipermetilación de genes individuales y, finalmente hipermetilación de la islas CpG de genes constitutivos y genes supresores de tumores. Los dos niveles de metilación pueden presentarse en forma individual o simultánea. En general, la hipermetilación está involucrada con el silenciamiento de genes y la hipometilación con la sobre-expresión de ciertas proteínas involucradas en los procesos de invasión y metástasis.

La hipermetilación de los promotores de muchos genes, tales como p16INK4a, p14ARF, APC, MGMT, LKB1, hMLH1, RASSF1A, CRBP1, RARB2 [8-10], es un acontecimiento habitual y temprano en la tumorigénesis colorrectal.

En los últimos años, los cambios en la metilación de los residuos de citosina de secuencias ricas en CpG (islas CpG) se han reconocido cada vez más como aberraciones moleculares muy habituales con supuesta utilidad clínica [34], En el cáncer colorrectal, los marcadores metilados son interesantes para la detección porque se producen con alta frecuencia en la neoplasia de fase temprana [35], Se ha propuesto la detección de la metilación de islas CpG en ADN humano aislado de heces [11-12,36] o de suero [37-39] como una estrategia novedosa para el diagnóstico precoz de la neoplasia colorrectal. Así, se ha evaluado el estado de metilación de la región promotora de genes tales como p16, MGMT, MLH1, SFRP2, HIC1 y vimentina en el ADN de heces, bien solos o bien usando un panel combinado [11-15,25,40, 48-53]. La metilación de SFRP2 es, hasta ahora, el marcador individual más sensible (sensibilidad del 77-90%). Sin embargo, tanto los marcadores metilados individuales como los combinados han estado obstaculizados por una proporción relativamente alta de falsos positivos.

La evaluación de la hipermetilación de promotores de genes en el ADN de heces podría proporcionar un enfoque valioso para la detección no invasiva de lesiones colorrectales tempranas [11-15], Sin embargo, la falta de especificidad demostrada hasta ahora dificulta su posible utilidad clínica. El ADN resultante de la exfoliación del epitelio colónico en la materia fecal es difícilmente amplificable debido a la gran cantidad de inhibidores de PCR que se encuentra en las heces.

En base a las necesidades y dificultades actuales para establecer un diagnóstico precoz no invasivo del cáncer colorectal con sensibilidad y especificidad suficiente, los autores de la invención han desarrollado un panel de biomarcadores de metilación en heces adecuados para su uso rutinario en la práctica clínica.

Así, tras un importante trabajo de investigación, han encontrado un panel de 5 marcadoresmetilados (RARB2, MGMT, p16NK4a, APC y p14ARF) que conjuntamente representan la mayoría de los tumores.

Tras hallar estos cinco marcadores, los autores de la invención, han desarrollado un nuevo método de diagnóstico precoz de cáncer colorectal basado en el análisis de las curvas de disociación mediante detección por PCR a tiempo real (RT PCR Melting curve, MC) del estado de metilación de los promotores de los 5 genes: RARB2, p16INK4a, MGMT, p14ARF y APC en el ADN de heces, demostrando una alta sensibilidad en la detección precoz de tumores de CCR y una excelente especificidad (ningún falso positivo en colonoscopias normales).

Este nuevo método permite la detección no invasiva de alteraciones neoplásicas premalignas y malignas del colon con alta sensibilidad y excelente especificidad, permitiendo su uso rutinario en la práctica clínica.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra las diferentes temperaturas de disociación según los marcadores y según el estado de metilación de la muestra (M: metiiado; U: no metilado).

En la figura 2 se muestra la prevalencia de la metilación en los diferentes marcadores analizados en el estudio en el ADN fecal (a) y en el tejido (b) en el conjunto de validación.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar cáncer colorectal basado en la determinación, en una muestra biológica obtenida de un sujeto, del estado de metilación del promotor de al menos uno de los genes APC, RARB2 y p14 y, opcionalmente, MGMT y p16.

Asimismo, es objeto de la presente invención un kit para llevar a cabo el método de la invención.

Descripción... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método in vitro para diagnosticar cáncer colorectal que comprende:

a. obtener una muestra biológica de un sujeto; y

b. determinar en la muestra biológica el estado de metilación del promotor de al menos uno de los siguientes genes: APC, RARB2 y p14.

2. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque el paso b) comprende determinar adicionalmente en la muestra biológica el estado de metilación del promotor de al menos un gen seleccionado entre p16 y MGMT.

3. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque el paso b) comprende determinar en la muestra biológica el estado de metilación de los promotores de los genes APC, RARB2, p16, MGMT y p14.

4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la muestra biológica es una muestra de heces.

5. Método, según la reivindicación anterior, caracterizado porque la determinación de la metilación se lleva a cabo en ADN fecal.

6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la determinación de la metilación se lleva a cabo mediante el análisis de la curva de disociación.

7. Kit de diagnóstico de cáncer colorectal, para llevar a cabo el método de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende un set de cebadores adecuado para la determinación en una muestra biológica del estado de metilación del promotor de al menos uno de los genes APC, RARB2 y p14.

8. Kit, según la reivindicación anterior, caracterizado porque comprende adicionalmente cebadores para la determinación del estado de metilación del promotor de al menos uno de los genes p16 y MGMT.

9. Kit, según la reivindicación anterior, caracterizado porque comprende un set de cebadores adecuado para la determinación del estado de metilación de los promotores de los genes APC, RARB2, p14, MGMT y p16.


 

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