El método comprende (i) poner en contacto un compuesto candidato no marcado con un array de membranas celulares en presencia de GTP marcado o de un análogo del mismo,

no hidrolizable, marcado, en condiciones que permitan la interacción entre dicho compuesto y dicho GPCR presente en dichas membranas celulares, y entre dicho GTP marcado o análogo del mismo y dicha proteína G presente en dichas membranas; (ii) lavar; y (iii) cuantificar la señal obtenida por la unión del GTP (o análogo) marcado a dicha proteína G. De aplicación en el análisis de la interacción entre compuestos y proteínas de receptores de membranas celulares y de los mecanismos de señalización intracelular que desencadena este mecanismo de interacción mediado por dichos compuestos

Método para cuantificar la unión receptor acoplado a proteína G (GPCR)-proteína G mediante el empleo de un array de membranas celulares.

Campo de la invención

La invención se relaciona, en general, con el empleo de un array de membranas celulares que contienen receptores de membrana acoplados a proteína G (GPCR) para el análisis de la interacción entre compuestos y las proteínas de receptores de membranas celulares, así como para el análisis de los mecanismos de señalización intracelular que desencadena este mecanismo de interacción mediado por tales compuestos (ligandos).

Antecedentes de la invención

Los receptores acoplados a proteínas G (G protein coupled receptors, GPCRs) se encuentran involucrados en numerosos procesos fisiológicos de señalización tanto a nivel intracelular como intercelular. Los GPCRs son receptores de hormonas, neurotransmisores y neuromoduladores y median sus acciones intracelulares a través de vías en las que están implicadas las proteínas G (rev: Kristiansen "Molecular mechanisms of ligand binding, signaling and regulation within the superfamily of G-protein coupled receptors: molecular modeling and mutagenesis approaches to receptor structure and function" Pharmacology and Therapeutics, 2004, 103, 21-80). Las proteínas G transmiten la señal intracelularmente a proteínas efectoras, como enzimas o canales iónicos, produciendo cambios en moléculas de señalización como AMPc, GMPc, inositol fosfatos, diacilglicerol, ácido araquidónico e iones. Su activación y regulación es uno de los procesos iniciales de los mecanismos de adaptación a nivel celular que disparan la activación de segundos mensajeros intracelulares y la activación de diversas cascadas de señalización, fosforilando enzimas y promoviendo la regulación a nivel génico, que en última instancia darán lugar a un determinado efecto fisiológico.

Existen dos clases principales de proteínas G, proteínas G heterotriméricas, que se unen a GPCRs y participan en los mecanismos de transducción de señales intracelulares, y las pequeñas proteínas G citoplasmáticas. Las primeras se componen de tres subunidades, a, ß y ?. Las subunidades ß? están estrechamente asociadas y pueden considerarse como una única unidad funcional. Con la unión del agonista, el receptor se activa y sufre un cambio conformacional que resulta en un incremento de su afinidad por la proteína G. Esto, permite una disociación rápida de GDP de su sitio de unión en la subunidad a. En condiciones fisiológicas normales, el GDP se reemplaza inmediatamente por GTP, cuya concentración supera a la de GDP varias veces. El cambio de los nucleótidos de guanina produce una reducción en la afinidad de la subunidad a por el complejo ß? y la consiguiente disociación del heterotrímero, en la subunidad a por un lado y el dímero ß? por otro. Cada una de las subunidades ya disociadas es capaz de promover la regulación de diferentes segundos mensajeros como el 5'-3'adenosín monofosfato (AMPc) o los inositol trifosfato (IP3), y activar diferentes cascadas de señalización lo que resulta en una gran variedad de funciones celulares. El estado activo dura hasta que el GTP se hidroliza a GDP por la actividad intrínseca GTPasa de las subunidades Ga. Una vez que se ha producido esta hidrólisis de GTP a GDP, las subunidades a-GDP y ß? se vuelven a unir y a ser inactivas.

Todas las proteínas G heterotriméricas siguen el mismo ciclo de activación/desactivación, permitiendo así una transmisión de la señal intracelular específica y de modo reversible. Cuando una molécula de GDP se une a la subunidad a, el complejo se asocia con las subunidades ß?, formando así un heterotrímero inactivo. A pesar de que el GDP unido a la subunidad a es capaz de unirse al receptor sin ß?, la asociación con el receptor resulta altamente incrementada en presencia de ß?.

Sin embargo, no todos los receptores que activan proteínas G son miembros de la superfamilia de GPCRs. La activación de las proteínas G está además implicada en la señal de transducción mediada por varios receptores de tirosin-kinasas, como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), insulina y factores de crecimiento similar a insulina I y II.

Los GPCRs se encuentran implicados en patologías como dolor, cáncer, asma, inflamación, trastornos metabólicos, inmunitarios, gastrointestinales y neurológicos. Se conocen alrededor de 500 GPCRs diferentes y todos ellos comparten la típica estructura molecular de 7 dominios hidrofóbicos de unos 30 aminoácidos cada uno que atraviesan la membrana celular, con un extremo carboxilo extracelular y un amino intracelular. La superfamilia de GPCRs comprende receptores para varias hormonas, neurotransmisores, paracrinas y neuromoduladores con funciones fisiológicas muy importantes. La alteración en el funcionamiento de estos receptores causa enfermedades humanas, y muchos de estos GPCRs son dianas para muchos fármacos y drogas de abuso. Esta superfamilia incluye receptores para diversos tipos de ligandos endógenos como las aminas, péptidos, aminoácidos, glicoproteínas, fosfolípidos, nucleótidos, iones calcio, etc. Se ha estimado que aproximadamente un 80% de las hormonas conocidas y neurotransmisores activan mecanismos de traducción de señales mediante la activación de GPCRs, que representan aproximadamente un 30-45% de las dianas para fármacos. Los GPCRs constituyen, por lo tanto, unas excelentes dianas terapéuticas para modular las interacciones ligando:receptor, de interés prioritario para el desarrollo de nuevos fármacos.

Actualmente el desarrollo de las técnicas de DNA recombinante ha permitido conseguir preparaciones celulares que sobreexpresan un determinado subtipo de GPCR. Las preparaciones enriquecidas con receptores de membrana, están disponibles comercialmente (por ejemplo Amersham Biosciences, PerkinElmer Life and Analytical Sciences), se pueden obtener como donaciones de otros grupos de investigación o se pueden preparar en un laboratorio de cultivos celulares mediante transfección de líneas celulares.

Actualmente los GPCRs constituyen la diana terapéutica de más del 30% de los fármacos que se encuentran en el mercado y sus ventas han reportado una gran parte de los beneficios de las empresas farmacéuticas, por ejemplo en el 2002 los 30 fármacos más vendidos a nivel mundial generaron más de 35 billones de dólares (Glasel "Emerging Concepts in GPCR research and their implications for drug discovery" Decision Resources 2004).

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una imagen autorradiográfica que muestra el marcaje obtenido a partir de un homogenizado de membranas depositado sobre un soporte gelatinizado. El diámetro de cada círculo es 1,5 mm.

La Figura 2 muestra una imagen autorradiográfica con el marcaje obtenido a partir de un homogenizado de membranas mezcladas con polilisina depositado sobre un soporte con resina hidrófoba para delimitar cada micropocillo. El diámetro de cada círculo es 1,5 mm.

La Figura 3 muestra las pruebas del prototipo de array de membranas celulares generado a partir de homogenizados de membrana procedentes de muestras de tejido de corteza cerebral de rata. En la Figura 3A se muestra la fijación basal, en ausencia de fármaco, del [³⁵S]GTP?S debida a la actividad constitutiva de los GPCRs. En la Figura 3B se muestra la estimulación de la fijación de [³⁵S]GTP?S por el fármaco agonista del receptor canabinoide CB1, WIN 55,212-2. La mayor intensidad de gris indica una mayor fijación del radioligando en los micropocillos incubados en presencia de fármaco agonista.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se relaciona, en general, con un array de membranas celulares. De forma más concreta, la invención se basa en un array de membranas celulares que contienen receptores de membrana acoplados a proteína G (GPCR) para el análisis de la interacción de compuestos (por ejemplo fármacos, etc.) y las proteínas de receptores de membranas celulares, así como para el análisis de los mecanismos de señalización intracelular que desencadena este mecanismo de interacción mediado por tales compuestos (ligandos).

En un aspecto, la invención se refiere a un método para cuantificar la unión receptor acoplado a proteína G (GPCR)-proteína G mediante el empleo de un array de membranas celulares que comprende:

1. Método para cuantificar la unión receptor acoplado a proteína G (GPCR)-proteína G mediante el empleo de un array de membranas celulares que comprende:

2. Método para analizar la unión GPCR-proteína G y cuantificar el efecto que esta unión promueve sobre un segundo mensajero intracelular mediante el empleo de un array de membranas celulares que comprende:

3. Método según la reivindicación 2, donde dicho GTP o análogo del mismo no hidrolizable está marcado.

4. Método según la reivindicación 2, donde dicho marcador de actividad de formación de un segundo mensajero celular marcado es ATP marcado o un análogo del mismo.

5. Método según la reivindicación 2, donde dicho marcador de actividad de formación de un segundo mensajero celular marcado es un análogo no hidrolizable de fosfatidil inositol 4,5 difosfato (PtdIns(4,5)P2) marcado o un análogo del mismo.

6. Método para cuantificar la unión compuesto-GPCR mediante el empleo de un array de membranas celulares que comprende:

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicho análogo de GTP no hidrolizable es GTP?S.

8. Método según la reivindicación 6, donde dicho GTP?S está marcado radiactivamente o con un fluoróforo.

9. Método según la reivindicación 8, donde dicho GTP?S es [³⁵S]GTP?S, 2'(3')-O-(N-metil-3'-antraniloil)-GTP?S o BODIPY-FL-GTP?S.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde cada uno de los microdepósitos de dicho array está constituido por membranas celulares aisladas de líneas celulares que sobreexpresan un determinado subtipo de receptor acoplado a proteína G o cualquier variación genética de los mismos.

11. Método según la reivindicación 10, donde dicho subtipo de receptor acoplado a proteína G es un receptor muscarínico para acetilcolina tal como M₁, M₂, M₃, M₄, M₅; un receptor de dopamina tal como D₁, D₂, D₃, D₄, D₅; un receptor adrenérgico tal como a_1A, a_1B, a_1D, a_2A, a_2B, a_2C, ß₁, ß₂, ß₃, ß₄; o un subtipo de GPCR para serotonina.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde cada uno de los microdepósitos de dicho array se caracteriza por estar constituido por membranas aisladas de líneas celulares que sobreexpresan un determinado subtipo de proteína G o cualquier variación genética de las mismas.

13. Método según la reivindicación 12, donde dicho subtipo de proteína G es cualquiera de los posibles subtipos de las tres familias, G_s, G_i/o o G_q.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicho compuesto candidato es un compuesto químico o un producto biológico.

15. Método según la reivindicación 14, donde dicho compuesto candidato es un compuesto químico o un producto biológico con afinidad y selectividad por un subtipo de GPCR.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde cada uno de los microdepósitos está formado por membranas aisladas de (i) diferentes tejidos de un mismo sujeto, o (ii) mismo tejido de individuos diferentes, de una misma especie, de especies diferentes o de especies modificadas genéticamente.

17. Método según la reivindicación 16, donde dichos tejidos de un mismo sujeto provienen de un mismo órgano o de órganos diferentes.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde cada uno de los microdepósitos está formado por membranas aisladas de líneas celulares o tejidos obtenidos a partir de individuos con diferentes patologías y/o tratamientos farmacológicos.