Método para la cuantificación, caracterización genética cualitativa y caracterización de la expresión génica de células predeterminadas.

Método para la caracterización genética cualitativa y/o de la expresión génica de células predeterminadas en una muestra líquida que contiene tales células, que comprende:

a) extraer selectivamente al menos una parte de las células predeterminadas a partir de la muestra, formando una suspensión celular cs0; y

b) repetir la etapa de extracción a) n veces con la misma muestra de la etapa a), con n ≥ 1, formando al menos una suspensión celular csn;

c) determinar un perfil de expresión génica gep0 y/o un primer recuento del número de copias cnc0 de al menos un ADN y/o ARN con al menos una parte de la suspensión celular cs0;

d) determinar al menos otro perfil de expresión génica gepn y/o un recuento adicional del número de copias cncn de al menos un ADN y/o ARN con al menos una parte de al menos otra suspensión celular csn;

e) calcular el perfil de expresión génica de las células predeterminadas gep

(P) de al menos un ADN y/o ARN predeterminado restando gepn de gep0 y/o el recuento del número de copias de las células predeterminadas cnc(P) de al menos un ADN y/o ARN predeterminado restando cncn de cnc0; y

f) evaluar las características genéticas cualitativas y/o de la expresión génica de las células predeterminadas procedentes de gep(P) y/o cnc(P).

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12000156.

Solicitante: AdnaGen GmbH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: OSTPASSAGE 7 30853 HANNOVER-LANGENHAGEN ALEMANIA.

Inventor/es: HAUCH,Siegfried.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

PDF original: ES-2529419_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método para la cuantificación, caracterización genética cualitativa y caracterización de la expresión génica de células predeterminadas En la presente invención, se proporciona un método para la caracterización genética cualitativa y/o la caracterización de la expresión génica de células predeterminadas en una muestra líquida que contiene tales células. Según la invención, un parámetro determinado para una mezcla de células predeterminadas y otras células se puede corregir de modo que solo se obtiene la contribución de las células predeterminadas al parámetro. La presente invención permite de este modo la determinación selectiva de perfiles de expresión génica y/o el número de copias de ADN y ARN en células predeterminadas, con alta precisión, a pesar de que dichas células predeterminadas están presentes en una mezcla con otras células. Además, la presente invención proporciona un método para la cuantificación selectiva de células predeterminadas en una mezcla de células predeterminadas y otras células.

Cuando se emplean inmunoperlas o técnicas de enriquecimiento celular comparables, para el enriquecimiento de células raras (por ejemplo, células tumorales circulantes = CTC) en fluidos corporales, tales como muestras de sangre, se observa con frecuencia un número de al menos 1000-10000 células contaminantes, no diana, nucleadas, presentes en la muestra enriquecida.

La obtención de perfiles moleculares de células raras en la sangre (por ejemplo, CTC) es limitado debido a la presencia de leucocitos contaminantes. El nivel de expresión de fondo de los leucocitos se puede estimar utilizando muestras de donantes sanos. Sin embargo, los leucocitos, incluso los de voluntarios sanos, siempre pueden diferir en su composición molecular y en su activación y/o estado de expresión. En concreto, el nivel intracelular o el número de copias intracelulares de ciertos ARNs en los leucocitos (su transcriptoma) es diferente no solo entre personas sanas y enfermas, sino también entre las personas sanas.

Esta diferencia es cada vez más importante, si las muestras de donantes sanos se utilizan como una referencia para muestras obtenidas a partir de pacientes que padecen una enfermedad como el cáncer, ya que el cáncer puede causar la presencia de leucocitos activados y una composición de leucocitos que difiere en gran medida en los leucocitos de personas sanas. En consecuencia, para una determinación correcta de la cantidad o el transcriptoma de ciertas células predeterminadas, la señal obtenida debe ser corregida restándola de una referencia ideal.

Se ha descubierto en experimentos con células predeterminadas que rara vez están presentes en fluidos corporales, tales como CTC, que la extracción selectiva de dichas células con inmunoperlas que comprenden anticuerpos contra dichas células, solo es efectiva hasta un cierto grado de pureza. Se ha observado que las muestras extraídas selectivamente, al final todavía contenían aproximadamente 1000 células distintas (por ejemplo, leucocitos u otras células nucleadas) como una contaminación cruzada. Experimentos repetidos indicaron que las células contaminantes no se pueden eliminar más por debajo de este límite. Se supone que la unión inespecífica de las células contaminantes (por ejemplo, leucocitos) a las inmunoperlas es la responsable de este efecto, es decir, la unión de las células contaminantes a las inmunoperlas no está causada por interacciones físicas específicas sino inespecíficas, las cuales se producen durante cada etapa de extracción y no se pueden evitar. Etapas adicionales de lavado redujeron la unión inespecífica, pero también redujeron la unión específica, conduciendo a una pérdida de sensibilidad.

Ante el problema de la contaminación cruzada como un problema inherente al procedimiento de purificación, el número de marcadores asociados a tumores es muy limitado. La razón es que la señal de fondo es tan alta que el marcador asociado a un tumor tiene que estar muy hiperexpresado en las células predeterminadas (por ejemplo, CTC) en comparación con las células contaminantes (por ejemplo, leucocitos) . Por ejemplo, una proporción de 1 célula predeterminada (por ejemplo CTC) frente a 1000-10000 células contaminantes (por ejemplo, leucocitos) requeriría una hiperexpresión de al menos 1.000 veces hasta 10.000 veces, del marcador asociado al tumor en las células predeterminadas, en comparación con las células contaminantes, para tener un diagnóstico fiable. Por lo general, esta proporción desventajosa de las células predeterminadas frente a las células contaminantes plantea restricciones significativas en la detección en términos de relación señal-ruido. Como consecuencia, la elección de los genes y los métodos para la elaboración de un perfil de expresión génica, están gravemente limitados (véase también O'Hara et al., Clin. Chem. (2004) 50: 5) .

Por lo tanto, para la mayoría de los genes que van a ser marcadores potenciales de enfermedades, un análisis preciso de la expresión génica apenas es posible si dicho gen se expresa tanto en las células predeterminadas como en las células contaminantes. En la técnica anterior, el análisis de la expresión génica de células predeterminadas en mezclas celulares está afectado por ello por un cierto error que se obtiene a partir de una señal de las células que no son las células predeterminadas (= el fondo o la referencia) .

En relación con la contaminación de CTC con leucocitos, algunos grupos han tratado de mejorar la relación entre señal y ruido mediante una estrategia llamada de enriquecimiento negativo (Liu et al, J. Transl. Med. (2011) , 9: 70) . Dicha estrategia tiene por objetivo reducir la contaminación con leucocitos en una muestra de CTC y leucocitos (relación de aproximadamente 1:103-104) mediante el agotamiento de los leucocitos con perlas magnéticas acopladas a un anticuerpo anti-CD45+. La estrategia tiene la desventaja de que las células predeterminadas también se unen al anticuerpo anti-CD45+ y se agotan también, y por lo tanto no se obtiene ninguna señal verdadera de las células

predeterminadas.

El problema subyacente de la invención es proporcionar la señal verdadera (por ejemplo, el nivel celular verdadero de ARNm y/o el recuento del número de copias de ADN) de las células predeterminadas en una muestra de células predeterminadas y otras células (contaminantes) . En otras palabras, la presente invención tiene por objeto eliminar las variaciones en los resultados que son inherentes a los métodos de la técnica anterior.

El problema de la técnica anterior se resuelve por el método para la caracterización genética cualitativa y/o la caracterización de la expresión génica de células predeterminadas según la reivindicación 1, el método para la cuantificación de células predeterminadas según la reivindicación 5, el método para el diseño de una terapia contra el cáncer según la reivindicación 14 y el método para pronosticar un cáncer según la reivindicación 15.

En un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para la caracterización genética cualitativa y/o la caracterización de la expresión génica de células predeterminadas en una muestra líquida que contiene tales células, que comprende a) extraer selectivamente al menos una parte de las células predeterminadas de la muestra, formando una suspensión celular cs0; y b) repetir la etapa de extracción a) n veces con la misma muestra de la etapa a) , con n ⥠1, formando al menos una suspensión de células csn;

c) determinar un perfil de expresión génica gep0 y/o un primer recuento del número del número de copias cnc0 de al menos un ADN y/o ARN con al menos una parte de la suspensión celular cs0;... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para la caracterización genética cualitativa y/o de la expresión génica de células predeterminadas en una muestra líquida que contiene tales células, que comprende:

a) extraer selectivamente al menos una parte de las células predeterminadas a partir de la muestra, formando una suspensión celular cs0; y b) repetir la etapa de extracción a) n veces con la misma muestra de la etapa a) , con n ⥠1, formando al menos una suspensión celular csn;

c) determinar un perfil de expresión génica gep0 y/o un primer recuento del número de copias cnc0 de al menos un ADN y/o ARN con al menos una parte de la suspensión celular cs0;

d) determinar al menos otro perfil de expresión génica gepn y/o un recuento adicional del número de copias cncn de al menos un ADN y/o ARN con al menos una parte de al menos otra suspensión celular csn;

e) calcular el perfil de expresión génica de las células predeterminadas gep (P) de al menos un ADN y/o ARN predeterminado restando gepn de gep0 y/o el recuento del número de copias de las células predeterminadas cnc (P) de al menos un ADN y/o ARN predeterminado restando cncn de cnc0; y f) evaluar las características genéticas cualitativas y/o de la expresión génica de las células predeterminadas procedentes de gep (P) y/o cnc (P) .

2. Método según la reivindicación 1, en el que el al menos un ARN se selecciona a partir del grupo que consiste en ARNm, ARNnc, ARNr, ARNt, ARNsn, ARNsno, ARNmi, ARNds y ARN vírico y/o el al menos un ADN se selecciona a partir del grupo que consiste en ADN celular, ADN vírico y ADN bacteriano.

3. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el perfil de expresión génica y/o el primer recuento del número de copias de al menos un ADN y/o ARN se determina mediante RT-PCR, qRT-PCR y/o mediante tecnología de microchip.

4. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la caracterización genética cualitativa y/o de la expresión génica comprende o consiste en una caracterización de los genes implicados en el metabolismo.

5. Método para la cuantificación de células predeterminadas en una muestra líquida que contiene tales células, que comprende

a) extraer selectivamente al menos una parte de las células predeterminadas desde la muestra, formando una suspensión celular cs0; y b) repetir la etapa de extracción a) n veces con la misma muestra de la etapa a) , con n ⥠1, formando al menos una suspensión celular csn;

c) determinar un primer recuento del número de copias cnc0 de al menos un ADN y/o al menos un gen predeterminado con al menos una parte de la suspensión celular cs0;

d) determinar al menos un recuento adicional del número de copias cncn de al menos un ADN y/o al menos un gen predeterminado con al menos una parte de al menos otra suspensión celular csn;

e) calcular el recuento del número de copias del ADN de las células predeterminadas y/o de al menos un gen predeterminado de las células predeterminadas restando cncn de cnc0; y f) correlacionar el recuento resultante del número de copias con el número de células predeterminadas que están presentes en la muestra líquida.

6. Método según la reivindicación precedente, en el que el recuento del número de copias de al menos un ADN y/o al menos un gen predeterminado está determinado por qPCR y/o por tecnología de microchip.

7. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la extracción en la etapa b) se repite 1-10 veces, preferiblemente 1-6 veces, lo más preferiblemente 1-2 veces.

8. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la extracción selectiva de al menos una parte de las células predeterminadas de la muestra se lleva a cabo mediante el uso de reactivos de extracción idénticos en la etapa a) y b) .

9. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa a) se efectúa poniendo en contacto la muestra al menos una vez con una fase sólida que se une preferentemente a las células predeterminadas, eliminando posteriormente las células no unidas de la fase sólida, preferiblemente lavando la fase sólida con al menos un tampón y eliminando posteriormente las células unidas de la fase sólida, preferiblemente lavando la fase

sólida con al menos un tampón adicional.

10. Método según la reivindicación precedente, en el que la fase sólida se selecciona a partir del grupo que consiste en polímeros, plásticos, cerámicas, vidrios, metales, sefarosa, agarosa y látex, preferiblemente la fase sólida son perlas magnéticas.

11. Método según una de las reivindicaciones 9-10, en el que la fase sólida comprende anticuerpos y/o derivados de anticuerpos, preferiblemente inmovilizados sobre la superficie.

12. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la muestra líquida comprende al menos partes de sangre periférica, médula ósea, orina, ascitis y esputo de un paciente.

13. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en el que las células predeterminadas se seleccio

nan a partir del grupo que consiste en células madre tumorales y células tumorales en transición epiteliomesénquima, preferiblemente células tumorales circulantes (CTC) .

14. Método para diseñar una terapia contra el cáncer, que comprende i) llevar a cabo el método según la reivindicación 1-4 y 7-13, en el que las células predeterminadas son células tumo

rales circulantes (CTC) ; y 15 ii) adaptar la terapia contra el cáncer basándose en la evaluación.

15. Método para pronosticar un cáncer, que comprende i) llevar a cabo el método según la reivindicación 5-13, en el que las células predeterminadas son células tumorales circulantes (CTC) ; y ii) proporcionar un pronóstico para el cáncer basándose en el número de CTC.

16. Método según la reivindicación anterior, en el que la etapa i) se lleva a cabo una primera vez y al menos una vez más posteriormente y un pronóstico bueno se proporciona si el número de CTC es menor al menos una vez posterior adicional que la primera vez y/o un pronóstico malo se proporciona si el número de CTC es mayor al menos una vez posterior adicional que la primera vez.