METODO PARA LA CONVERSION DE ISOFORMAS DE INTERFERON Y PRODUCTOS DE LAS MISMAS.

Un método para aumentar el rendimiento de una composición de interferón alfa,

que comprende la conversión de una isoforma adjunta de piruvato de interferón alfa en interferón alfa, donde dicha isoforma adjunta se expone a la solución de zinc

Durante el transcurso de esta descripción, se citan varias publicaciones, patentes y solicitudes de patentes. Campo de la Invención

La presente invención concierne al aislamiento y purificación de proteínas. En particular, la presente invención concierne al aislamiento de proteínas, aislamiento de isoformas de proteínas y la conversión de isoformas a las proteínas deseadas. Antecedentes

Las proteínas que se producen de manera natural se usan ampliamente para fines de investigación y clínicos. Mientras que dichas proteínas puedan obtenerse de su fuente natural, las técnicas recombinantes pueden permitir la producción de esas proteínas a partir de fuentes no naturales. Por ejemplo, la fermentación de microorganismos construidos mediante tecnología recombinante, tal como bacterias transformadas, producen grandes cantidades de interferón humano a un coste sustancialmente menor que el que es posible utilizando fuentes naturales. Estas técnicas recombinantes de ADN también se han utilizado para producir otras proteínas importantes, tales como la insulina y el activador tisular del plasminógeno.

Las bacterias alteradas mediante técnicas recombinantes sin embargo, también producen contaminantes e isoformas estructurales de la proteína que se pretende producir. Esos contaminantes e isoformas incluyen proteínas oligoméricas e isoformas de proteínas reducidas (véase la Patente de Estados Unidos Nº 4.765.903 de D'Andrea et al.), residuos celulares y virus (véase la Patente de Estados Unidos Nº 4.732.663 de Georgiadis et al.) e isoformas ligadas al piruvato (véase Rose et al., J. Biol. Chem. 287: 19101 (1992); Prome et al., J. Biol. Chem. 266:13050 (1991); Stevens et al., J. Biol. Chem. 252:2998 (1977); y Shapiro et al., J. Biol.. Chem. 255:3120 (1980)). Es deseable eliminar estos contaminantes durante la purificación de la proteína.

Claramente, estas isoformas de proteínas reducen la pureza de la proteína deseada y los procesos para la eliminación de las isoformas reducen el rendimiento total. Si, sin embargo, las isoformas de proteína se pueden convertir en la proteína deseada, su eliminación es innecesaria y los rendimientos de proteína totales aumentarían significativamente. Lo que se necesita es una forma de identificar isoformas de proteína no deseadas y convertirlas en la proteína deseada. La presente invención aborda estas necesidades.

La presente invención se refiere a métodos para la preparación de proteínas altamente purificadas en rendimientos altos mediante el aislamiento de isoformas adjuntas y la conversión de las mismas en una proteína funcional deseada. En una realización, la presente invención proporciona un método para el aumento del rendimiento de una composición de interferón alfa, que comprende la conversión de una isoforma adjunta de piruvato de interferón alfa en interferón alfa, dónde dicha isoforma adjunta se expone a una solución de zinc. Mientras que la presente invención no se limita a un interferón alfa particular, en una realización preferida el interferón alfa es interferón alfa2b.

La presente invención se refiere a métodos para la conversión de una isoforma adjunta producida de manera recombinante en la proteína deseada que comprende la eliminación química de un grupo escindible de la isoforma adjunta.

En la presente invención, el grupo de escisión comprende piruvato.

En cuanto al método de la eliminación química del grupo de escisión, en el presente documento se describe un método que comprende la exposición de la isoforma adjunta a una solución ácida. Cuando la isoforma adjunta es una isoforma adjunta de piruvato de interferón alfa, se prefiere que la solución ácida sea tenga aproximadamente un pH de 5,5. En este caso, se prefiere además que la solución ácida esté a 34-40ºC. En la invención, sin embargo, la isoforma adjunta se expone a una solución de zinc. En una realización preferida, la solución de zinc está de pH 7,8 a pH 8,6. En otra realización preferida, la solución de zinc está a 30-38ºC.

La presente descripción tampoco está limitada mediante el tipo de solución ácida o de zinc utilizada. En realizaciones preferidas, la solución ácida (descrita en el presente documento) o la solución de zinc (usada en esta invención) comprende un antioxidante en realizaciones particularmente preferidas, el antioxidante comprende metionina. En dicha realización, la concentración preferida de metionina es 5-40 µM. Definiciones

Como se usa en el presente documento, la expresión “proteína deseada” significa una proteína de interés que se pretende purificar. La identificación de la proteína deseada está, por supuesto, sujeta al objetivo final del procedimiento de purificación. Por ejemplo, durante un procedimiento de purificación puede ser deseable obtener un grupo o grupos de proteínas, incluyendo contaminantes, en una etapa intermedia del proceso de purificación. Independientemente del interés en la obtención de un grupo de proteínas intermedio, el grupo de proteínas que es el objetivo final del procedimiento de purificación se considera la proteína deseada.

Como se usa en el presente documento, la expresión “isoforma adjunta” significa una isoforma de proteína que tiene características estructurales o funcionales similares a una proteína deseada, dónde puede eliminarse un grupo de escisión de la proteína para producir la proteína deseada. Se entiende que un “grupo de escisión” significa un grupo químico unido a una proteína deseada que puede eliminarse químicamente. “Eliminación química” o “eliminado químicamente” como se usa en el presente documento se entiende que indica que un grupo químico se ha separado de una proteína mediante medios químicos, incluyendo, pero sin limarse a, solución ácida, soluciones básicas, catálisis de iones metálicos, etc.

Si el grupo de escisión se puede identificar químicamente, la isoforma adjunta se puede denominar tipo específico de isoforma adjunta. Por ejemplo, una “isoforma adjunta de piruvato” es una proteína deseada que tiene un grupo de escisión unido que se identifica como piruvato.

Como se usa en el presente documento, la expresión “reacción de oxidación” significa una reacción que pretende provocar que los grupos sulfhidrilo de dos aminoácidos de cisteína formen enlaces disulfuro.

Como se usa en el presente documento, la expresión “interferón alfa” se refiere a una familia de proteínas secretadas inducibles que confieren resistencia a virus en células diana, inhiben la proliferación celular y regulan la expresión de antígenos MHC de clase I. Esta familia incluye, pero sin limitación interferón alfa-2a (Roferon, Hoffman La-Roche, Nutley, NJ), interferón alfa 2b (Intron, Schering-Plough, Madison, NJ), interferón alfa-2c (Berofor Alpha, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania) o interferón de consenso como se define por determinación de una secuencia consenso de interferones alfa que se producen de manera natural (Infergen, Amgen, Thousand Oaks, CA).

Descripción Detallada de la Invención

La presente invención concierne al aislamiento y purificación de proteínas. En el presente documento se describen la identificación y purificación de isoformas adjuntas. En otra realización, la presente invención se refiere a métodos para la producción de una proteína deseada a partir de isoformas adjuntas. También se describe en el presente documento una proteína deseada altamente purificada mediante la copurificación de la proteína deseada junto con isoformas adjuntas y la subsiguiente conversión de las isoformas adjuntas en la proteína deseada. De este modo, la cantidad de la isoforma adjunta está reducida y el rendimiento total de la proteína deseada está aumentado y/o la purificación es más alta que la que se podía conseguir previamente. El rendimiento de la proteína deseada se puede aumentar tanto como diez veces el rendimiento obtenido sin convertir las isoformas adjuntas.

Mientras que la presente invención no está limitada por la fuente de la proteína deseada o las isoformas adjuntas, en una realización, la fuente son los microorganismos construidos mediante técnicas recombinantes. Hay muchas de estas técnicas que conocen los expertos en la materia. Estos microorganismos transformados pueden ser células eucariotas o procariotas, bacterias, células de mamífero, etc. Por ejemplo, el interferón alfa se puede producir en bacterias siguiendo...

1. Un método para aumentar el rendimiento de una composición de interferón alfa, que comprende la conversión de una isoforma adjunta de piruvato de interferón alfa en interferón alfa, donde dicha isoforma adjunta se expone a la solución de zinc.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho interferón alfa es el interferón alfa2b.

3. El método de la reivindicación 1 en el que dicha solución de zinc de pH 7,8 a pH 8,6.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicha solución de zinc está a 30-38ºC.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicha solución de zinc comprende un antioxidante.

6. El método de la reivindicación 5, en el que dicho antioxidante comprende metionina.

7. El método de la reivindicación 6, en el que dicha metionina está a una concentración de 5-40 mM.

8. El método de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente la purificación de dicho interferón alfa2b usando cromatografía.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicha cromatografía comprende cromatografía de afinidad de los colorantes basada en agarosa seguida de cromatografía de intercambio aniónico basada en agarosa, que se sigue de una etapa de cristalización.