MÉTODO PARA LA CONSERVACIÓN Y/O ALMACENAMIENTO DE CÉLULAS CON ACTIVIDAD DE NITRILASA O NITRILOHIDRATASA.

Método para la conservación y/o almacenamiento de células con actividad de nitrilasa o nitrilohidratasa La invención se refiere a un método para la conservación y/o almacenamiento de microorganismos que exhiben por lo menos una actividad enzimática de nitrilasa, donde la conservación y/o almacenamiento ocurre en un medio acuoso, el cual incluye por lo menos un aldehído, donde la concentración total de aldehído está en un rango de 0,1 a 100 mM/l y donde el aldehído es descrito por la fórmula general III: donde R 6 puede ser un radical alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido, ramificado o no ramificado, alquenilo C2-C10 sustituido o no sustituido, ramificado o no ramificado, arilo o hetarilo sustituido o no sustituido. Las enzimas producidas por microorganismos encuentran creciente aplicación como biocatalizadores en métodos de producción química. En particular la hidrólisis enzimática de nitrilos para dar amidas, ácidos carboxílicos o ácidos hidroxicarboxílicos es un método de alta importancia económica. Las enzimas que hidrolizan nitrilos se subdividen en las familias de nitrilohidratasas y las nitrilasas. Las nitrilohidratasas y nitrilasas poseen en el centro activo una molécula de cisteína que es esencial para la catálisis (Levy-Schil (1995) Gene 161:15-20). Las nitrilohidratasas catalizan la adición de un equivalente molar de agua a la correspondiente amida. Las nitrilasas catalizan la adición de dos equivalentes molares de agua al correspondiente ácido carboxílico. Por regla general las enzimas en cuestión causan una hidratación ópticamente selectiva o bien hidrólisis, que conducen a productos ópticamente activos (quirales). Los ácidos carboxílicos quirales son productos buscados para la síntesis química orgánica. Ellos son productos de partida para una multiplicidad de principios activos farmacéuticos o principios activos para el cuidado de las plantas. Los ácidos carboxílicos quirales pueden ser empleados para la escisión clásica de racematos por sales de diastereoisómeros. De este modo por ejemplo se emplea ácido R-(-)- o S-(-)-mandélico para la escisión de racemato de aminas racémicas. Además se usa ácido R-(-)-mandélico como producto intermedio en la síntesis. Comúnmente, para las transformaciones enzimáticas se emplean enzimas purificadas o parcialmente purificadas o también microorganismos con las correspondientes actividades enzimáticas. Las enzimas pueden ser de origen natural o recombinante. Por regla general la producción (expresión) de la enzima ocurre en una etapa anterior a la transformación. En ello es deseable producir grandes cantidades de enzima y, dependiendo de la necesidad, incorporarlas en el proceso catalítico. Sin embargo, esto hace necesario un almacenamiento para obtener la actividad enzimática. En ello, el enfriamiento y/o congelación son métodos estándar. Sin embargo, la mayoría de las veces el congelamiento exige métodos complejos de congelación/descongelación y se acompaña por regla general con una pérdida grave de actividad enzimática. El enfriamiento en general está ligado a costos logísticos y costos de energía. EP-A1 O 666 320 describe un método para la producción de ácidos -hidroxicarboxílicos/amidas a partir de los correspondientes nitrilos, donde antes de la reacción se incuban los microorganismos empleados, en presencia de sulfito de sodio (1 M) y tampón de fosfato (50 mM). Además, durante la reacción puede estabilizarse adicionalmente la actividad enzimática mediante adición de fosfito o hipofosfito, donde dicha adición causa una complejación de aldehído libre inhibidor de enzima. La EP-A1 0 610 048 describe un método microbiano para la producción de - hidroxiácidos, donde se estabiliza la actividad enzimática durante la reacción mediante adición de sulfito de sodio, lo cual causa asimismo una complejación de aldehído libre que inhibe enzima. En dicho método se permite la adición uniforme durante la transformación del nitrilo. No se manifiestan métodos para la estabilización antes del uso en la reacción. Los métodos típicos de obtención de actividades dependientes de cisteína son un empleo de ditiotreitol y/o mercaptoetanol y/o ácido etilendiaminotetraacético (ejemplo: Nitrilase de Rhodococcus rhodochrous J1; Kobayashi M (1989) Eur J Biochem 182: 349-356). La estabilización de nitrilasa de Rhodococcus sp. ATCC 39484 fue lograda mediante la adición de sustrato (benzonitrilo) (Stevenson DE (1992) Biotechnol Appl Biochem 15:283-302). Para la velocidad de estabilización de nitrilasa de Rhodococcus rhodochrous NCIB 11216 son responsables aparte de la concentración de sustrato, un pH básico, la temperatura y la concentración de enzima (Harper BH (1976) Biochem Soc Trans 4:502-504; Harper BH (1977) Biochem J 165:309-319). Aquí es una desventaja que el estabilizante es transformado por la enzima y de este modo pierde con el tiempo su efecto. 2   Para la estabilización de la actividad enzimática de la nitrilasa de Rhodococcus rhodochrous J1 se describió la adición de sales inorgánicas (entre otras hasta 20% (NH4)2SO4) y alcoholes (hasta 50% de glicerina, 10% de etanol) (Nagasawa T (2000) Eur J Biochem 267:138-144). Para la estabilización de la actividad enzimática de nitrilasa de Alcaligenes faecalis JM3 se describió la adición de 60% de sulfato de amonio, NaCl 2M o 30% de propanodiol (Nagasawa T (1990) Eur J Biochem 194:765-772). EP-A1 0 707 061 describe métodos para la estabilización de células que contienen nitrilasa mediante la adición de sales inorgánicas (fosfatos, boratos, sulfatos, sulfitos, clorhidratos) para el tampón de almacenamiento con una concentración de por lo menos 100 mM hasta el límite de saturación. US 4,931,391, EP-A1 0 243 967 y US 4,900,672 describe la estabilización de una actividad de nitrilohidratasa mediante la adición a la suspensión celular de amidas o ácidos carboxílicos (o una combinación de las sustancias). US 4,343,900 describe un método para la producción de acrilamida a partir de acrilonitrilo, donde se añaden carbonatos de metales alcalinos a la mezcla de reacción, para evitar la pérdida de actividad por hinchamiento de las células fijas empleadas. US 6,251,646 y US 6,368,804 describen métodos para la estabilización de microorganismos que portan actividad de nitrilasa mediante la adición de (hidrogeno)carbonatos de amonio, sodio o potasio en concentraciones de por lo menos 0,1 M hasta la concentración de saturación. Debido a los grupos aldehído reactivos, los aldehídos son clasificados como sustancias inhibidoras de las enzimas. Su efecto inhibidor de nitrilasas durante el proceso de producción es enfatizado en numerosas publicaciones (EP-B1 0 773 297 B1, p. 4 párrafos [0013] y [0025]; EP-B1 0 707 061 B1, p.2 párrafo [0005]; EP-B 1 0 666 320, p. 2 párrafo [0004] y citas de literatura allí planteadas; EP-A2 0 486 289 p. 2 fila 30 y citas de literatura allí planteadas; Yamamoto (1992) J Ferm Technol 73:425-430, en particular p. 429 del último párrafo). La reducción de la actividad nitrilasa / nitrilohidratasa en el almacenamiento es un factor esencial de costos en el aprovechamiento industrial de la mencionada enzima. Por ejemplo la actividad a 4_C y pH 6,0 por un período de tiempo de 6,6 días cae a 36 %, lo cual significa una pérdida de actividad de 5,5 % por día (ver Fig. 1; ensayo de comparación en el ejemplo 3). Una pérdida de actividad en nitrilasas puede consistir por ejemplo en una desintegración del multímero de la enzima en sus monómeros, los cuales no poseen ninguna actividad de nitrilasa (Nagasawa T (1990) Eur J Biochem 194:765-772). Los métodos descritos son capaces de solucionar este problema sólo de modo muy limitado. Además dicho método emplea elevadas concentraciones de aditivos para la estabilización de los biocatalizadores, los cuales además después del empleo del biocatalizador tienen que ser separados y dispuestos de manera costosa. De acuerdo con esto, el objetivo en el que se basaba la invención consistió en poner a disposición un método que hiciera posible una estabilización tan perdurable como fuera posible de una actividad de nitrilasa sin que se contaminara la mezcla de reacción con indeseadas sustancias colaterales. Este objetivo fue logrado mediante el método acorde con la invención. Una primera etapa de la invención se refiere a un método para la conservación y/o almacenamiento de microorganismos, que exhiben por lo menos una actividad enzimática de nitrilasa, donde la conservación y/o almacenamiento ocurre en un medio acuoso en el cual incluye por lo menos un aldehído, donde la concentración total de aldehído está en un rango de 0,1 a 100 mM/l, donde el aldehído es descrito mediante la fórmula general III: donde R 6 puede ser alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido, ramificado o no ramificado, alquenilo C2-C10 sustituido o no... [Seguir leyendo]

1. Método para la conservación y/o almacenamiento de microorganismos que exhiben por lo menos una actividad enzimática de nitrilasa, donde la conservación y/o almacenamiento ocurren en un medio acuoso el cual incluye por lo menos un aldehído, donde la concentración total de aldehído está en un rango de 0,1 a 100 mM/l, donde el aldehído es descrito por la fórmula general III: donde R 6 puede ser alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido, ramificado o no ramificado, alquenilo C2-C10 sustituido o no sustituido, ramificado o no ramificado, arilo o hetarilo sustituido o no sustituido. 2. Método según la reivindicación 1, donde la etapa de conservación es ejecutada antes de añadir a las células un reactivo cuya reacción va a ser catalizada por las células. 3. Método según una de las reivindicaciones 1 o 2, donde el medio acuoso contiene una concentración total en compuestos de cianuro, elegidos de entre el grupo consistente en nitrilos, ácido cianhídrico y sales de cianuro, que son máximo 10 % molar de la concentración total de aldehído o donde el medio acuoso no contiene adición de dichos compuestos de cianuro. 4. Método para la conservación y/o almacenamiento de microorganismos que exhiben por lo menos una actividad de nitrilasa, donde la conservación y/o almacenamiento ocurre en un medio acuoso que incluye por lo menos un aldehído, donde el aldehído es elegido de entre el grupo que incluye benzaldehído no sustituido y benzaldehídos sustituidos y donde la concentración total de aldehído está en un rango de 0,1 a 100 mM/l. 5. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, donde el microorganismo es elegido de entre las clases de las familias Enterobacteriaceae o Nocardiaceae. 6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5, donde el microorganismo es elegido de entre el grupo de los tipos Pseudomonas, Burkholderia, Nocardia, Acetobacter, Gluconobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostridium, Cyanobacter, Staphylococcus, Aerobacter, Alcaligenes, Rhodococcus y Penicillium. 7. Método según una de las reivindicaciones 1 a 6, donde se combina el método con por lo menos otro método para la estabilización, conservación y/o almacenamiento de enzimas, donde dichos métodos son elegidos de entre el grupo compuesto por: a) adición de por lo menos una sal inorgánica en una concentración de por lo menos 100 mM; b) adición de sales metálicas cuyo catión metálico actúa como grupo prostético de la nitrilasa; c) adición de nitrilos y/o amidas. 21   22   23