Método de carga de muestras para electroforesis sumergida en gel de agarosa.

La presente invención se refiere a un método de carga de muestras de ácidos nucleicos para electroforesis sumergida en gel de agarosa donde la carga de cada muestra individualizada se realizada mediante a) la obtención de la muestra líquida de ácidos nucleicos a analizar; b) la obtención de un soporte sólido individual; c) la adsorción de la muestra líquida en el soporte sólido individual; y d) el depósito del soporte sólido individual conteniendo la muestra en un pocillo del gel de agarosa para el desarrollo de la electroforesis de los ácidos nucleicos en el gel, donde la carga de las muestras se realiza antes de sumergir el gel de agarosa en un tampón de migración. Asimismo se contempla el dispositivo de carga para llevar a cabo dicho método y el kit de electroforesis basado en el empleo de dicho dispositivo

Método de carga de muestras para electroforesis sumergida en gel de agarosa.

Campo de la invención

La presente invención tiene su campo de aplicación dentro del área de la Biología Molecular, concretamente en el campo de las técnicas de electroforesis. En particular, esta invención se refiere a un método de carga de muestras de ácidos nucleicos para electroforesis sumergida en gel de agarosa, así como al dispositivo que emplea dicho método y a un kit de electroforesis basado en dicho dispositivo.

Antecedentes de la invención

La electroforesis es una técnica analítica de separación de macromoléculas. La separación tiene lugar debido a la diferente movilidad que presentan las macromoléculas cargadas cuando son sometidas a la influencia de un campo eléctrico como consecuencia de su relación carga/masa.

Los ácidos nucleicos son macromoléculas cargadas negativamente, debido a la presencia de grupos fosfato en su estructura. La naturaleza del enlace fosfodiéster de las cadenas polinucleotídicas condiciona la carga de un ácido nucleico, que es aproximadamente igual al número de grupos fosfato.

La electroforesis se realiza en cubetas apropiadas, generalmente horizontales, con un electrodo a cada extremo, y requiere dos elementos indispensables: la fase móvil y la fase estacionaria. La fase móvil es el medio amortiguado que permite la movilidad de las moléculas cargadas hacia los electrodos correspondientes cuando se genera un campo eléctrico. La fase estacionaria o soporte, es un polímero de naturaleza gelatinosa con un tamaño de poro homogéneo que se haya sumergido y embebido en la fase móvil.

El polímero utilizado para el análisis electroforético de ácidos nucleicos de gran tamaño (100 pb-10 kb) es la agarosa. Esta técnica consiste en armar un gel de agarosa, con pequeñas hendiduras o pocillos en un extremo donde se depositan las muestras a analizar. El gel es sometido a corriente eléctrica de modo que los ácidos nucleicos, cargados negativamente, se desplazan por el gel hacia el polo positivo. Transcurrida la electroforesis, la localización relativa de los fragmentos se determina mediante distintos métodos de detección. La tinción con bromuro de etidio, una sonda fluorescente tras iluminación con luz UV, es un método generalizado de detección de fragmentos de ADN, ya que la sonda se intercala entre la doble hélice de ADN y emite luz. La separación efectiva de los fragmentos de ADN o ARN (resolución) depende tanto de la masa como de la carga de los distintos fragmentos (relación carga/masa).

En las técnicas habitualmente realizadas, el depósito de las muestras de ácidos nucleicos en los pocillos del gel de agarosa se realiza en fase líquida, según la siguiente metodología estándar:

Las micropipetas de precisión son de coste elevado y, además, deben manejarse con sumo cuidado para evitar su descalibración. Así, el depósito de la muestra en fase líquida debe realizarse de manera precisa y muy cuidadosa para evitar flujos bruscos que provoquen la salida de la muestra del pocillo y por tanto la pérdida de la muestra que se desea analizar. Por otra parte, debe evitarse la perforación de la base del pocillo con la punta de la micropipeta.

El equilibrio preciso entre introducir la punta de la micropipeta en el pocillo a una altura que no perfore la base del mismo y realizar un impulso adecuado del líquido que contiene la muestra hace de ésta una técnica difícil para personas que la efectúan por primera vez o que no la llevan a cabo de forma regular.

No obstante, el depósito de la muestra es una etapa clave en la migración electroforética y, en caso de no ejecutarse correctamente, impide obtener resultados de electroforesis.

En base a este hecho, existen documentos en el estado de la técnica que tienen el objetivo común de facilitar el depósito de las muestras en los geles de electroforesis.

Así, en el documento US 6376231, se describe un cargador para el depósito de varias muestras, formado por un papel intercambiador de cationes para cromatografía, para electroforesis vertical en gel de poliacrilamida, diseñado para la totalidad del gel.

Por otra parte, los documentos US5681437 y US5683915 describen un mecanismo para depositar simultáneamente una pluralidad de muestras sobre un medio en fase sólida planar, tal como el usado en técnicas cromatográficas, electroforéticas o cromatografía en capa fina, o sobre medios de crecimiento planares, tales como agarosa o tejido.

En el documento US 99/12025 se describe un cargador de muestras en fase sólida para la totalidad del gel, similar al descrito en US 6376231. Al igual que en este documento, la finalidad de su mecanismo es su empleo en electroforesis en geles verticales de poliacrilamida. Así, se describe un soporte sólido de polietersulfona o nylon capaz de inmovilizar muestras de ensayo de forma reversible para facilitar la carga de las mismas en geles de electroforesis.

Sin embargo, en ninguno de los documentos mencionados se define un dispositivo de carga de soporte sólido para electroforesis sumergida en geles de agarosa. Además, en los métodos descritos se emplea la totalidad del gel. Por otra parte, el diseño de estos sistemas no permite eliminar el uso de micropipetas a la hora de depositar las muestras en los soportes de carga.

Los documentos WO9627787 y WO9800706 se refieren a un dispositivo de carga para electroforesis sumergida en gel de agarosa, basado en un cargador de muestras para la totalidad del gel, es decir, para la carga simultánea de una pluralidad de muestras, cuyo diseño consiste en un medio sólido poroso donde se depositan las muestras para posteriormente transferirlas al gel. La forma de este medio soporte es la del peine utilizado habitualmente para formar los pocillos durante la polimerización del gel. El material del cargador es una membrana de nylon o nitrocelulosa. Este dispositivo ha sido diseñado para proceder a la carga de las muestras en el gel una vez sumergido en el buffer de migración.

Este tipo de cargadores presentan dos inconvenientes. Por un lado, la introducción del cargador (peine) debe realizarse con bastante precisión, ya que cada una de las zonas de muestra (púas del peine) debe quedar bien alojada en cada uno de los pocillos del gel, ya que, si alguna queda fuera, la difusión no se realizaría correctamente. La complejidad, por tanto, viene derivada del hecho de tener que introducir simultáneamente todas las púas en los correspondientes pocillos, teniendo en cuenta que la solución migratoria se encuentra cubriendo el gel.

Por otro lado, el peine es un cargador para varias muestras, lo cual dificulta la deposición de las muestras individuales. Esto supone una barrera metodológica importante cuando son personas distintas las que depositan cada una de las muestras, por ejemplo, en labores de docencia, en las que cada alumno va a depositar una muestra y debe realizarla en el mismo cargador que el resto de los alumnos.

Además, el diseño de este cargador tampoco evita el empleo de micropipetas de precisión para el depósito de las muestras.

Así, pese a que los dispositivos de carga descritos tienen el objetivo común de facilitar el depósito de las muestras en los geles de electroforesis, no existen referencias bibliográficas en el estado de la técnica que permitan eliminar el empleo de micropipetas de precisión.

Por tanto, los mecanismos descritos han sido desarrollados solamente para su utilización en investigación. La migración electroforética con fines docentes es difícil y por tanto se hace necesario resolver el problema del depósito de las muestras en gel de agarosa.

En el caso de los geles de almidón para la separación electroforética de proteínas obtenidas de extractos crudos celulares (Allozyme Electrophoresis Techniques used by the Gene Conservation Laboratory;<http://www.cf.adfg.state. ak.us/geninfo/research/genetics/techfac/electro2.php>), la carga de muestras se...

1. Método de carga de muestras de ácidos nucleicos para electroforesis sumergida en gel de agarosa caracterizado porque la carga de cada muestra individualizada comprende las siguientes etapas:

donde la carga de las muestras se realiza antes de sumergir el gel de agarosa en un tampón de migración.

2. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque el soporte sólido individual tiene un área similar a la del pocillo del gel de agarosa en el que se deposita en la etapa d).

3. Método, según la reivindicación 2, caracterizado porque el soporte sólido individual es de celulosa.

4. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa c) se realiza introduciendo el soporte sólido individual en un recipiente que contiene un volumen de muestra líquida suficiente para impregnar dicho soporte.

5. Dispositivo para la carga de muestras de ácidos nucleicos para electroforesis sumergida en gel de agarosa según el método de las reivindicaciones 1-4.

6. Kit de electroforesis de muestras de ácidos nucleicos sumergida en gel de agarosa caracterizado porque comprende un dispositivo de carga según la reivindicación 5.