METODO DE ANALISIS INMUNOLOGICO, SU UTILIZACION Y KIT PARA SU REALIZACION.

El objeto de la presente invención es un método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana (anti-hGSTT1).

Constituye igualmente un objeto de la presente invención la utilización de dicho método de análisis inmunológico para el diagnóstico, pronóstico de aparición, seguimiento y monitorización de condiciones patológicas asociadas a la presencia en fluidos biológicos de anti-GSTT1, así como un conjunto de útiles (kit) para la puesta en práctica de dicho método

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200702641.

Solicitante: FUNDACION REINA MERCEDES PARA LA INVESTIGACION SANITARIA.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: SEVILLA.

Inventor/es: NUEZ ROLDAN,ANTONIO, AGUILERA GARCIA,ISABEL, WICHMANN SCHLIPF,INGEBORG.

Fecha de Solicitud: 27 de Septiembre de 2007.

Fecha de Publicación: 26 de Enero de 2010.

Fecha de Concesión: 13 de Enero de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

C07K16/18 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales animales o humanos.
G01N33/574V

Clasificación PCT:

C07K16/18 C07K 16/00 […] › contra materiales animales o humanos.
G01N33/53 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.

Fragmento de la descripción:

Método de análisis inmunológico, su utilización y kit para su realización.

Sector de la técnica

El sector de la técnica en el que se encuadra la presente invención es el médico-sanitario, y su ámbito de aplicación es el de los sistemas de análisis para el diagnóstico de procesos autoinmunes y para la prevención del rechazo a trasplantes. También podría ser de interés para investigadores del campo de la investigación biomédica y clínica.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención es un método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana (anti-hGSTT1). Constituye igualmente un objeto de la presente invención la utilización de dicho método de análisis inmunológico para el diagnóstico, pronóstico de aparición, seguimiento y monitorización de condiciones patológicas asociadas a la presencia en fluidos biológicos de anti-GSTT1, así como un conjunto de útiles (kit) para la puesta en práctica de dicho método.

Estado de la técnica

Dentro del fenómeno de la autoinmunidad, las investigaciones sobre la tolerancia o el rechazo de células o tejidos en pacientes trasplantados han demostrado la naturaleza multifactorial de ambos procesos. De esta forma, por ejemplo, se han identificado los fenómenos de alo-reconocimiento y reacción alo-inmune, por los cuales genes expresados en el material trasplantado darían lugar a la aparición de anticuerpos (alo-anticuerpos) en el paciente receptor que ocasionarían el rechazo a ciertos trasplantes (Aguilera, I., et al (2001). Clin Exp Immunol, 126, 535-539). Recientemente se ha descrito por primera vez la existencia de una nueva forma de rechazo a trasplantes de hígado, que afecta principalmente a niños. Ésta da lugar a una enfermedad caracterizada por la presencia de alteraciones histológicas propias de la hepatitis crónica, una elevada concentración de IgG, aparición de anticuerpos no-órgano-específicos y respuesta a tratamientos inmunosupresores. De ahí que se la haya denominado hepatitis de novo post-trasplante (Kerkar, N., et al (1998). Lancet, 351, 409-413; Jones, D.E., et al (1999). Hepatology, 30, 53-57). Debido a que clínicamente es indistinguible de otras hepatitis, el diagnóstico diferencial de la hepatitis de novo post-trasplante es difícil y a menudo requiere la práctica de biopsias, con las consecuentes molestias para el paciente. Éstas revelan alteraciones histológicas poco frecuentes, como necrosis en puente (porto-portal y porto-central), daños centrolobulillares e interrupciones periportales, y junto con otros datos serológicos, radiológicos y de biología molecular ayudan a confirmar el diagnóstico (Salcedo, M., et al (2002). Hepatology, 35, 349-356). Aunque no se conocen los mecanismos que controlan su evolución, distintos estudios apoyan la hipótesis de que la hepatitis de novo post-trasplante está originada por una respuesta de tipo alo-inmune contra un antígeno expresado en el órgano del donante (Aguilera, I., et al (2001). Clin Exp Immunol, 126, 535-539; Aguilera, I., et al (2004). Liver Transpl, 10, 1166-1172; Rodriguez-Mahou, M., et al (2007). Transplantation, 83, 1126-1129). De este modo se ha identificado una proteína, la Glutation-S-Transferasa T1 (GSTT1), que parece desempeñar un papel importante en el desarrollo de esta nueva patología, actuando como un alo-antígeno. La GSTT1 es un enzima implicado en la destoxificación celular, y sus niveles de expresión son elevados en eritrocitos, hígado, riñón y otros tejidos. Esta proteína es codificada por un gen polimórfico simple que tiene dos alelos, positivo o nulo, lo que explica su ausencia en un 20% de la población caucásica y entre un 11 y un 58% de individuos de otros orígenes étnicos (Sprenger, R., et al (2000). Pharmacogenetics, 10, 557-565; Landi, S., (2000). Mutat Res, 463, 247-283). Estudios en pacientes receptores de un hígado trasplantado con síntomas clínicos y signos analíticos propios de la hepatitis de novo post-trasplante, revelan la presencia de niveles elevados de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 (anti-GSTT1). El análisis genético de estos casos ha demostrado que el donante era positivo para el gen de la GSTT1, y por tanto, el hígado trasplantado expresaba este enzima. Por el contrario, el paciente receptor era carente en la GSTT1 (Aguilera, I., et al (2004). Liver Transpl, 10, 1166-1172; Rodriguez-Mahou, M., et al (2007). Transplantation, 83, 1126-1129). Estas investigaciones refuerzan la hipótesis alo-inmune de la hepatitis de novo post-trasplante, presentan la incompatibilidad GSTT1 como un elemento fundamental en su desarrollo, y apuntan a los anticuerpos anti-GSTT1 como marcadores de rechazo a trasplantes. Por otra parte, se ha demostrado la presencia de anticuerpos anti-GSTT1 en pacientes receptores de otros tipos de trasplantes, por ejemplo de riñón, y también en pacientes que no recibieron ningún órgano sólido, pero que en algún momento necesitaron una transfusión sanguínea o bien experimentaron un embarazo (Aguilera, I., et al (2005). Transplantation Proceedings, 37, 1457-1458; Aguilera, I., et al (2005). Am JKidney Dis, 46, 345-350; Wichmann, I., et al (2006). Transfusion, 46, 1505-1509). En algunos de estos pacientes se ha podido confirmar la correlación entre la aparición de anticuerpos contra la GSTT1 y el desarrollo de una respuesta alo-inmune con síntomas clínicos adversos (Aguilera, I., et al (2007). Tissue Antigens, 69, 396).

Los métodos para detectar anticuerpos anti-GSTT1 existentes en la actualidad, consisten en ensayos de inmunofluorescencia indirecta y ensayos Western Blot (Rodríguez-Díaz, Y., et al (2006). Transplantation Proceedings, 38, 1467-1470; Aguilera, I., et al (2005). Transplantation Proceedings, 37, 3968-3969). En los ensayos de inmunofluorescencia indirecta, diferentes diluciones de las muestras a analizar se ponen en contacto con células o tejidos portadores del antígeno específico y fijados en porta-objetos. De esta forma, los anticuerpos presentes en las muestras se unen a los antígenos expuestos en el porta-objeto, formando complejos antígeno-anticuerpo. Estos complejos son detectados mediante la unión a los mismos de otros anticuerpos anti-inmunoglobulinas humanas marcados con fluoresceína, y la observación bajo el microscopio de la fluorescencia resultante. La mayor dilución de una muestra capaz de producir una fluorescencia detectable en el microscopio por el ojo humano, se establece como el título del anticuerpo (Wheatley, S.P., et al (1998). Methods Cell Biol, 57, 313-332). En los ensayos Western Blot, las muestras a analizar se ponen en contacto con membranas, de nitrocelulosa o de polivinil-dieno-difluoruro, que contienen extractos celulares procedentes de bacterias modificadas genéticamente con un vector de clonación con el cDNA de la GSTT1, que le permite expresar niveles suficientes del antígeno específico. En este caso, los complejos antígeno-anticuerpo formados son detectados mediante la unión a los mismos de otros anticuerpos fusionados a un enzima, la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, que produce una reacción colorimétrica o quimioluminiscente en presencia de sustratos específicos. Los resultados se interpretan como positivos o negativos para un anticuerpo, dependiendo de si aparece o no reacción en la membrana (Simons, B., et al (2006). J Immuno.l Methods, 315, 88-98). Ambas técnicas, inmunofluorescencia indirecta y Western Blot, pueden ser válidos para la detección de anticuerpos. Sin embargo, son métodos de análisis semi-cuantitativos, complejos, poco automatizables y laboriosos para su realización.

Explicación de la invención

Constituye un primer objeto de la presente invención un método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana (anti-hGSTT1) que incluye las siguientes etapas:

(a) Expresión en un organismo heterólogo y purificación de la proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas;

(b) inmovilización de dicha proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas en un soporte;

(c) contacto de dicha proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas con el fluido biológico a ser testado, en condiciones tales que los anticuerpos presentes en el fluido biológico con especificidad para...

Reivindicaciones:

1. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana (anti-hGSTT1) que incluye las siguientes etapas:

a) Expresión en un organismo heterólogo y purificación de la proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas;

b) inmovilización de dicha proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas en un soporte;

c) contacto de dicha proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas con el fluido biológico a ser testado, en condiciones tales que los anticuerpos presentes en el fluido biológico con especificidad para dicha proteína hGSTT1 recombinante, se unen a dicho material formando complejos antígeno-anticuerpo;

d) separación de anticuerpos no unidos y otros componentes del fluido biológico de los complejos antígeno-anticuerpo;

e) medida de la cantidad de complejos antígeno-anticuerpo detectada en el fluido biológico, que será positivamente correlacionada con la cantidad de anticuerpos anti-GSTT1 definida por el control positivo.

2. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana según las reivindicación 1 caracterizado porque la proteína hGSTT1 recombinante marcadora se expresa fusionada a una secuencia polipeptídica con al menos 5 aminoácidos de histidinas que le permite su purificación por afinidad a soportes cromatográficos de intercambio iónico.

3. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana según la reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la la proteína hGSTT1 recombinante marcadora se expresa y purifica en un microorganismo, en particular en una cepa de E. coli, portador del plásmido pCASb-GSTT1.

4. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana según las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque el soporte en el cual se inmoviliza dicha proteína hGSTT1 recombinante marcadora es cualquier superficie que permita dicha inmovilización y el posterior análisis de la unión del anticuerpo anti-hGSTT1, preferentemente pocillos de una placa multipocillo, una membrana de nylon, filtro de celulosa, membrana de nitrocelulosa, una micropartícula coloreada, una micropartícula fluorescente, una superficie de cristal o un soporte metálico.

5. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana según la reivindicación 4, caracterizado porque el soporte de inmovilización de la proteína hGSTT1 recombinante marcadora y del anticuerpo anti-hGSTT1 es una micromatriz de polipéptidos en superficie plana.

6. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la etapa de detección de los complejos antígeno-anticuerpo se lleva a cabo mediante Western Blot.

7. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la etapa de detección de los complejos antígeno-anticuerpo se lleva a cabo mediante técnica de ELISA.

8. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la etapa de detección de los complejos antígeno-anticuerpo se lleva a cabo mediante micropartículas codificadas recubiertas por la proteína hGSTT1 recombinante marcadora.

9. Utilización del método de análisis inmunológico detector en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1, para el diagnóstico de condiciones patológicas asociadas a la presencia en fluidos biológicos de anticuerpos anti- GSTT1, para el pronóstico de aparición de condiciones patológicas asociadas a la presencia en fluidos biológicos de anti-GSTT1 o para el seguimiento y monitorización de condiciones patológicas asociadas a la presencia en fluidos biológicos de anti-GSTT1.

10. Utilización del método de análisis inmunológico según la reivindicación 9, caracterizado porque los fluidos biológicos en los que se detecta la presencia de anti-GSTT1 son hemoderivados.

11. Utilización del método de análisis inmunológico según las reivindicaciones 9 y 10, caracterizado porque la condición patológica es el rechazo de células, tejidos u órganos procedentes de un trasplante, injerto o transfusión.

12. Utilización del método de análisis inmunológico según la reivindicación 11 caracterizado porque el órgano transplantado es el hígado, el riñón, el corazón, la médula ósea o cualquier otro órgano donde se exprese la secuencia hGSTT1.

13. Utilización del método de análisis inmunológico según la reivindicación 12, caracterizado porque el órgano transplantado es el hígado.

14. Utilización del método de análisis inmunológico según la reivindicación 12, caracterizado porque el órgano transplantado es el riñón.

15. Utilización del método de análisis inmunológico según la reivindicación 11, caracterizado porque la condición patológica es el rechazo en pacientes transfundidos con sangre o cualquier hemoderivado desde donadores que expresan la secuencia hGSTT1.

16. Conjunto de útiles (Kit) para la realización del método de análisis inmunológico detector en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1, caracterizado porque incluye:

a) un soporte en el cual se ha inmovilizado la proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas.

b) un anticuerpo secundario anti IgG humano conjugado a moléculas indicadoras, preferentemente enzimas, fluoróforos, micropartículas coloreadas o micropartículas fluorescentes que permite revelar la unión al anticuerpo anti-hGSTT1 en un suero prueba cuando se pone en contacto con el soporte en el cual se ha inmovilizado la la proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas.

c) medios para la detección de la actividad de las citadas moléculas indicadoras conjugadas al anticuerpo secundario IgG humano.

d) un suero humano control que contiene anticuerpos anti-hGSTT1.

e) un suero humano control que no contiene anticuerpos humanos anti-hGSTT1.

17. Conjunto de útiles (Kit) según la reivindicación 16, caracterizado porque está compuesto por:

a) una placa multipocillo apta para la detección de los complejos antígeno- anticuerpo mediante técnica de ELISA, con la proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas inmovilizada en cada uno de los pocillos.

b) un vial de anticuerpo secundario anti IgG humano conjugado a peroxidasa.

c) un vial con un sustrato indicador de la actividad enzimática peroxidasa, preferentemente 3,3',5,5' tetrametil benzidina.

d) control positivo consistente en una muestra diluida de suero humano inactivado con anticuerpos anti-GSTT1.

e) control negativo consistente en una muestra diluida de suero humano sin anticuerpos anti-hGSTT 1.

f) soluciones tamponadas para realizar diluciones de la muestra a analizar, del anticuerpo secundario conjugado, de los controles y del sustrato enzimático indicador correspondiente.

18. Conjunto de útiles (Kit) según la reivindicación 16, caracterizado porque está compuesto por:

a) una placa multipocillo apta para la detección de los complejos antígeno-anticuerpo mediante técnica de ELISA, con la proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas inmovilizada en cada uno de los pocillos.

b) un vial de anticuerpo secundario anti IgG humano conjugado a fosfatasa alcalina.

c) un vial con un sustrato indicador de la actividad enzimática fosfatasa alcalina, preferentemente p-nitrofenil fosfato disódico.

d) control positivo consistente en una muestra diluida de suero humano inactivado con anticuerpos anti-GSTT1.

e) control negativo consistente en una muestra diluida de suero humano sin anticuerpos anti-hGSTT 1.

f) soluciones tamponadas para realizar diluciones de la muestra a analizar, del anticuerpo secundario conjugado, de los controles y del sustrato enzimático indicador correspondiente.

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