Método para el análisis de ácidos nucleicos que comprende las etapas de

mezclar un ácido nucleico diana con un primer cebador y un segundo cebador para formar una mezcla,

estando loscebadores configurados para amplificar el ácido nucleico diana, en el que el primer cebador comprende un elementosonda específico para un locus del ácido nucleico diana y una región cebadora específica de plantilla, en el que elelemento sonda se encuentra en 5' de la región cebadora específica de plantilla, y en el que el primer cebador es unoligonucleótido que no presenta ningún colorante ni inhibidor unido covalentemente;

amplificar el ácido nucleico diana para generar un amplicón,

permitir que el elemento sonda se hibride al locus para formar una horquilla, y

generar una curva de fusión para el elemento sonda midiendo la fluorescencia de un colorante que une los dsADNcuando se calienta la mezcla, en el que el colorante no está unido covalentemente al primer cebador.

Método para el análisis de fusión de ácidos nucleicos

PRIORIDAD

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de patente de Estados Unidos Número 60/905.721 solicitada el 8 de marzo del 2007, titulada Primers for Melting Analysis (“Cebadores para el análisis de fusión”) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El proyecto del genoma humano ha conseguido secuenciar la mayoría de regiones del ADN humano. El trabajo de identificación de los genes y alteraciones en las secuencias asociadas con enfermedades continúa a un ritmo rápido. Se utilizan estudios de ligamiento para asociar un fenotipo con marcadores genéticos, tales como repeticiones simples de la secuencia o polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) para identificar genes candidatos. Las alteraciones en las secuencias, que incluyen SNP, inserciones y deleciones que provocan mutaciones de sentido erróneo, desplazamientos del marco o de corte y empalme, se pueden utilizar entonces para localizar el gen y el espectro de mutaciones responsables.

Sin embargo, incluso cuando los detalles genéticos son conocidos, es difícil utilizar este conocimiento en la práctica médica de rutina, en gran parte porque los métodos para analizar el ADN son caros y complejos. Cuando los costes disminuyan de manera significativa y los métodos se simplifiquen drásticamente, se espera que los análisis de ADN sean accesibles para la utilización en la práctica clínica diaria para la detección eficaz de enfermedades y un mejor tratamiento. El análisis ideal de ADN es rápido, sencillo y económico.

Cuando una enfermedad está causada por un número limitado de mutaciones, o cuando unas cuantas alteraciones en las secuencias constituyen una proporción amplia de los casos de enfermedades, es viable el genotipado directo. Los métodos tradicionales varían desde la digestión por restricción clásica de productos de PCR hasta métodos fluorescentes en tubo cerrado. Los métodos en tubo cerrado del análisis de ADN pueden ser sencillos de realizar. Una vez se inicia la PCR, no son necesarias adiciones o separaciones posteriores de reactivo. Sin embargo, los métodos en tubo cerrado son habitualmente caros debido, en gran parte, al coste de las sondas fluorescentes utilizadas. Aunque existen muchos diseños refinados, las sondas son a menudo complejas con múltiples colorantes fluorescentes y/o grupos funcionales. Por ejemplo, una estrategia habitual utiliza una sonda fluorescente y un inhibidor (“quencher”) , unidos cada uno de manera covalente a una sonda específica de alelo (1) . Son necesarias dos de estas sondas “TaqMan®” para obtener el genotipo de un SNP. No sólo son costosas las sondas, sino que el tiempo requerido para la hibridación y la separación con la exonucleasa también limita la velocidad a la se puede realizar la PCR.

Otro ejemplo de genotipado con tubo cerrado utiliza cebadores Scorpion®, disponibles de DxS Ltd. Los cebadores Scorpion®, o "amplicones de autosondeo, " descritos originalmente en 1999, se forman durante la PCR a partir de un cebador que incluye una extensión 5’ que comprende un elemento sonda, una pareja de secuencias tallo autocomplementarias, una pareja de fluoróforo/inhibidor y un monómero de bloqueo para evitar la copia de la extensión 5’ (2) . Tal como se ilustra en la figura 1, en el formato de tallo-bucle original, el elemento sonda forma el bucle, y el tallo acerca de manera próxima el fluoróforo y el inhibidor. Después de la PCR, el elemento sonda se hibrida a una parte del producto de extensión, abriendo el tallo y separando el fluoróforo del inhibidor. Posteriormente, se desarrolló un formato de doble cadena adicional, también mostrado en la figura 1, en que el fluoróforo en el cebador Scorpion® es inhibido por un inhibidor en una sonda complementaria separada que forma una doble cadena antes de la PCR (3) . Después de la PCR, el elemento sonda, que ahora es parte del amplicón, se separa de la sonda inhibidora y se hibrida al amplicón. En ambos casos, el sondeo es una reacción intramolecular.

Existen varias ventajas de las reacciones intramoleculares sobre las sondas intermoleculares. En primer lugar, la hibridación intramolecular es rápida y no es una etapa limitante, incluso con los protocolos PCR actuales más rápidos (4) . El elemento de sonda se estabiliza mediante la reacción intramolecular, incrementando las temperaturas de fusión de la sonda en aproximadamente 5-15ºC, de manera que se pueden utilizar sondas más cortas, de manera ilustrativa en áreas de variación de secuencia elevada. En el formato de tallo-bucle, un único nucleótido sirve como uno de los cebadores y como sonda. Sin embargo, dichas sondas pueden ser complejas y caras. El coste elevado está provocado por la complejidad elevada para producir ciertas sondas. Por ejemplo, cada cebador Scorpion® requiere tres modificaciones en el cebador de oligonucleótido (un fluoróforo, un inhibidor y un bloqueador) . Sería deseable un sistema de genotipado de tubo cerrado que mantenga las ventajas de los cebadores Scorpion®, pero que elimine su complejidad y coste.

Se ha utilizado otro método para el genotipado “Polimorfismo de conformación de cadena simple Snapback o SSCP”. El SSCP utiliza un cebador de una secuencia específica para introducir una estructura secundaria en los

productos de la PCR que son posteriormente separados mediante electroforesis para revelar los polimorfismos de conformación de cadena simple (“SSCP”) (5) . En el SSCP Snapback, una cola del cebador complementario de 8-11 pb forma un bucle cerrado en su secuencia complementaria en el producto de extensión, creando una horquilla en el amplicón de cadena simple, que posteriormente se detecta mediante separación en gel.

Tal como se ha descrito más arriba, se pueden utilizar cebadores Snapback para introducir una estructura secundaria de bucle en un producto de extensión. Sin embargo, los cebadores Snapback y otros métodos de la técnica anterior divulgados en la presente invención dependen de la separación en gel posterior a la amplificación, o la utilización de caros cebadores marcadores de manera fluorescente. En comparación, los métodos de la presente invención utilizan un colorante de dsADN y un análisis de fusión para hacer un seguimiento de la hibridación de la horquilla. Según un aspecto de la presente solicitud, después de la PCR, de manera ilustrativa, pero sin limitarse a una PCR asimétrica, la fusión intramolecular de la horquilla permite el genotipado. La hibridación intramolecular se muestra en la figura 2. El método es sencillo porque sólo son necesarios dos cebadores de PCR, siendo la única adición una cola 5’ de nucleótidos en, como mínimo, un cebador. No se requieren fluoróforos, inhibidores o bloqueadores covalentes, reduciendo ampliamente el coste de la síntesis y el desarrollo de ensayos. De este modo, en una realización ilustrativa, el colorante de dsADN se desencadena y está libre para unirse y ser liberado del ácido nucleico solamente en base a la fusión.

Una cuestión que ha impedido un método mejor de genotipado gira en torno al hecho de que la mayoría de enfermedades genéticas son complejas. Muchas alteraciones diferentes en las secuencias en los mismos o diferentes genes pueden contribuir a un fenotipo de la enfermedad. La esperanza inicial de que la mayoría de enfermedades humanas estén causadas por un grupo de variantes de secuencia se ha demostrado que no es cierta. Muchos genes pueden contribuir a un fenotipo particular y muchas mutaciones diferentes en un gen pueden causar los mismos patrones de la enfermedad o similares. Por lo tanto, para determinar la unión entre un genotipo y su fenotipo resultante, las pruebas genéticas requieren a menudo un análisis paralelo de muchas regiones codificantes y reguladoras. Existen varios métodos de cribado de ADN para anormalidades y son conocidos como métodos de “rastreo”. Mientras que el “genotipado” se centra en la detección de alteraciones específicas en las secuencias, el rastreo de mutaciones puede señalar la presencia de una anormalidad, la cual se puede identificar a continuación a través de métodos, tales como el genotipado o la secuenciación.

La secuenciación es actualmente el patrón de referencia para la identificación de la variación de secuencia. Aunque están disminuyendo los costes, la secuenciación es todavía un proceso complejo que no es rápido, sencillo o económico cuando se aplica al diagnóstico genético... [Seguir leyendo]

1. Método para el análisis de ácidos nucleicos que comprende las etapas de mezclar un ácido nucleico diana con un primer cebador y un segundo cebador para formar una mezcla, estando los

cebadores configurados para amplificar el ácido nucleico diana, en el que el primer cebador comprende un elemento sonda específico para un locus del ácido nucleico diana y una región cebadora específica de plantilla, en el que el elemento sonda se encuentra en 5’ de la región cebadora específica de plantilla, y en el que el primer cebador es un oligonucleótido que no presenta ningún colorante ni inhibidor unido covalentemente; amplificar el ácido nucleico diana para generar un amplicón,

permitir que el elemento sonda se hibride al locus para formar una horquilla, y generar una curva de fusión para el elemento sonda midiendo la fluorescencia de un colorante que une los dsADN cuando se calienta la mezcla, en el que el colorante no está unido covalentemente al primer cebador.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que el primer cebador se suministra a una concentración superior a la del 15 segundo cebador para la amplificación asimétrica.

3. Método, según la reivindicación 1, en el que el primer cebador comprende además una región 5’ con error de apareamiento del elemento sonda.

4. Método, según la reivindicación 1, en el que el primer cebador no presenta un bloqueador de extensión.

5. Método, según la reivindicación 1, en el que el primer y segundo cebadores son suministrados esencialmente a la misma concentración, y en el que el segundo cebador comprende un elemento sonda específico para un segundo locus del ácido nucleico diana y una región cebadora específica de plantilla, en el que el elemento sonda del

segundo cebador se encuentra 5’ de la región cebadora específica de plantilla.

6. Método, según la reivindicación 5, que comprende además la etapa de diluir el amplicón antes de la generación de una curva de fusión.

7. Método, según la reivindicación 1, en el que la horquilla presenta un bucle de entre 20 y 50 bases.

8. Método, según la reivindicación 1, en el que elemento sonda es inferior a 10 bases.

9. Método, según la reivindicación 1, en el que el locus presenta un polimorfismo de un solo nucleótido conocido y el

polimorfismo de un solo nucleótido está localizado no más próximo de 8 bases desde un extremo del elemento sonda.

10. Método, según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico diana comprende además un segundo locus, y

la región cebadora específica de plantilla del primer cebador está configurada para amplificar el ácido nucleico diana sólo si está presente un alelo concreto del segundo locus.

11. Método, según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de analizar la forma de la curva de fusión.

45 12. Método, según la reivindicación 1, en el que la mezcla se ajusta para favorecer la formación de horquillas en el elemento sonda antes de la generación de la curva de fusión.

13. Método, según la reivindicación 1, en el que la amplificación se termina antes de alcanzar la fase de

estabilización, para limitar la concentración de amplicón. 50