Método de amplificación de ADN basado en los orígenes de replicación del bacteriófago {ph}29 y secuencias nucleotídicas asociadas.

La presente invención se refiere a un método de amplificación de ADN basado en los orígenes de replicación del bacteriófago {ph}29, así como a las construcciones génicas, vectores y oligonucleótidos que pueden emplearse en dicho método para amplificar una secuencia exógena de interés.

Método de amplificación de ADN basado en los orígenes de replicación del bacteriófago φ29 y secuencias nucleotídicas

asociadas.

La presente invención pertenece al campo de la Biología Molecular y se refiere a un método de amplificación de ADN basado en los orígenes de replicación del bacteriófago φ29, así como a las construcciones génicas, vectores y oligonucleótidos que pueden emplearse en dicho método para amplificar una secuencia exógena de interés.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Las técnicas de amplificación de ADN son de gran importancia para la biología molecular. Las más utilizadas son la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y la Amplificación por Desplazamiento Múltiple (MDA) . Aunque la PCR tiene la ventaja de ser muy eficaz y generar segmentos definidos de ADN, no es capaz de amplificar secuencias de más de 20 kilobases (Kb) de longitud.

A pesar de que los métodos más comunes de comenzar la replicación del ADN son aquellos en los que se usa como cebador una molécula de ADN o de ARN, la síntesis de ADN también puede comenzar utilizando una proteína como cebador. Este tipo de sistemas inician la síntesis de ADN utilizando como receptor del primer enlace fosfodiéster, el grupo OH de un residuo específico de serina, treonina o tirosina presente en una proteína determinada, en lugar del grupo 3' OH de una ribosa. Esta proteína se denomina generalmente proteína terminal (TP) , ya que queda unida covalentemente al extremo 5' del ADN. Se han hecho estudios sobre toda una serie de sistemas relativos a la replicación de ADN mediante iniciación con TP, tales como algunos bacteriófagos (φ29, Nf, GA-1, PRD1 o Cp-1) , plásmidos lineales provenientes de bacterias (pSCL y pSLA2) , ADN mitocondrial, ADN de levaduras y ADN de plantas, cromosomas bacterianos (Streptomyces sp.) y ADN de virus de mamíferos (Adenovirus) (Salas, M. 1991. Annu. Rev. Biochem. 60, 39-71) .

También se han descrito métodos in vivo para generar cadenas lineales de ADN con TP unida a los extremos 5' para plásmidos de Streptomyces (Shiffman, D. y Cohen, S. N. 1992. Proc Natl Acad Sci USA 89, 6129Ǧ 33) y para Adenovirus (Crouzet, J et al, 1997 Proc Natl Acad Sci USA 94, 1414Ǧ 9) . Estos métodos parten de la observación de que un ADN que contiene las secuencias adecuadas pero que carece de TP unida puede, tras la transformación y selección en el huésped apropiado, adquirir dentro de la célula las TP necesarias para replicarse y mantenerse de modo estable. La obtención de un TP-ADN conlleva realizar los pasos de clonación adecuados para que en el plásmido se den las señales requeridas para llevar a cabo la replicación basada en la TP. Seguidamente, la construcción de ADN ha de someterse a un proceso de clonación y selección en un huésped adecuado y, finalmente, el ADN ha de extraerse del mismo y purificarse para el propósito deseado. Todos estos pasos pueden limitar el tamaño y restringir el tipo de secuencias que se pueden clonar, mantener y obtener de modo estable. Hasta la fecha ninguno de estos sistemas se ha utilizado para producir cantidades sustanciales de TP-ADN para diversos usos en biología molecular.

Respecto a la aproximación in vitro, el sistema más eficaz es el basado en la replicación del ADN de φ29. Gutiérrez et al, (Nucleic Acids Research 1988. 16 (13) ; 5895-5914) describen el análisis de los orígenes mínimos de iniciación y replicación in vitro en los extremos izquierdo y derecho del ADN del bacteriófago φ29, y que dichos orígenes mínimos comprenden los 12 nucleótidos terminales. Dentro de estos 12 nucleótidos, los 3 nucleótidos terminales no pueden ser mutados sin disminuir la eficiencia de iniciación y replicación, mientras que la secuencia en posiciones menos terminales no es tan necesario que sea exacta. También se describen la iniciación y la replicación de ADN in vitro basada en los orígenes de replicación de φ29 en presencia de la ADN polimerasa de φ29 y de la TP de φ29, pero no se refiere a la amplificación de ADN.

WO9010064 describe un método para amplificar una secuencia de ADN de hasta varios cientos de Kb flanqueada por

los orígenes de replicación de φ29, específicamente los 12 nucleótidos del extremo izquierdo del ADN de φ29 a un lado y los 12 nucleótidos del extremo derecho del ADN de φ29 al otro, en presencia de la ADN polimerasa de φ29 y de la TP de φ29. WO9010064 describe oligonucleótidos que comprenden los 12 nucleótidos del extremo izquierdo del ADN de φ29. Sin embargo, el método descrito en WO9010064 se basa en los resultados de Gutiérrez et al (1988) , que no se

refieren a la amplificación de ADN, sino a la replicación de ADN. Los resultados expuestos en Blanco et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol 91; 12198-12202) , demuestran que la amplificación de ADN descrita en WO9010064 no es posible y que, por tanto, lo descrito en esta patente en cuanto a la amplificación de ADN es erróneo, ya que la amplificación de ADN no puede llevarse a cabo con tan solo los 12 nucleótidos del extremo del ADN de φ29.

Blanco et al (1994) , describen que para la amplificación eficiente in vitro del ADN de φ29 es necesaria la presencia, no solo de la ADN polimerasa y la TP de φ29, sino también de cantidades elevadas de las proteínas p5 y p6 de φ29.

El hecho de que la TP esté unida covalentemente al genoma de φ29 que se va a amplificar hace que la reacción de amplificación sea mucho más eficiente. No se conoce aún si la unión covalente de la TP a los extremos del ADN de φ29

es imprescindible para que se produzca la amplificación de dicho ADN, ni si sería posible amplificar mediante el mismo sistema un ADN heterólogo que no lleva TP unida a sus extremos.

El genoma del φ29 es conocido desde los años 80 (Yoshikawa e Ito, 1982 Gene 17, 323-335; Garvey et al, 1985 Gene 40, 301-309; Vlcek y Paces, 1986 Gene 46, 215-225) .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

El inicio de la replicación, partiendo de moldes con extremos de ADN de φ29 que carecen de proteína terminal (TP) , es mucho menos eficaz que el inicio llevado a cabo con el genoma de φ29 como molde, puesto que el genoma, junto con los extremos adecuados, contiene la TP unida covalentemente al fosfato 5' de los extremos de ambas cadenas de ADN.

La presente invención muestra algo que no se había hecho hasta ahora y prueba experimentalmente la amplificación de ADN in vitro comparando la del el genoma de φ29 que lleva TP covalentemente unida en sus extremos (TP-ADN) y otros moldes con regiones terminales del ADN de φ29, pero sin TP, empleando la maquinaria mínima de amplificación de φ29.

Los autores de la presente invención han definido que para que un ADN lineal pueda ser objeto de amplificación mediante el sistema de φ29, ha de tener extremos del ADN de φ29 totalmente funcionales, dispuestos en la orientación correcta y unidos en un solo fragmento de ADN.

Los orígenes mínimos de replicación del ADN de φ29 descritos en el presente trabajo no necesitan tener la TP unida covalentemente a los extremos 5’ para ser funcionales en amplificación y pueden unirse al ADN que se desea amplificar mediante diferentes métodos comunes en biología molecular, como son ligación, recombinación o clonación.

El proceso de replicación y el de amplificación in vitro del ADN lleva estudiándose décadas y ha sido necesario llevar a cabo experimentalmente cada reacción para conocer con certeza los requerimientos mínimos para que dichas replicación y amplificación fuesen funcionales.

El presente trabajo expone un método para amplificar isotérmicamente y de modo definido fragmentos grandes de ADN mediante su inserción entre dos secuencias de ADN que contienen los orígenes mínimos de replicación del ADN del bacteriófago φ29. Este método genera productos que poseen TP unida covalentemente a los extremos 5' del ADN amplificado, puesto que la TP se utiliza como “iniciador universal” para todas las amplificaciones realizadas mediante

este sistema.

La extremadamente alta procesividad intrínseca y la capacidad para acoplar la polimerización al desplazamiento de banda de la ADN polimerasa de φ29, le permiten llevar a cabo amplificaciones de ADN de gran longitud.

Los amplicones de TP-ADN resultantes pueden utilizarse directamente... [Seguir leyendo]

1. Una construcción génica adaptada para la introducción de una secuencia nucleotídica exógena que comprende al menos una secuencia nucleotídica que comprende los siguientes tres elementos en el siguiente orden:

a) un origen de replicación del bacteriófago φ29, que comprende al menos 68 nucleótidos del extremo del ADN del bacteriófago φ29, cuyo extremo terminal va seguido por,

b) al menos un punto de corte de la secuencia nucleotídica,

c) origen de replicación del bacteriófago φ29, que comprende al menos 68 nucleótidos del extremo del ADN del bacteriófago φ29, en orientación opuesta a la de la secuencia nucleotídica de (a) .

2. La construcción génica según la reivindicación anterior donde las secuencias nucleotídicas de los tres elementos están yuxtapuestas o superpuestas.

3. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde las secuencias nucleotídicas de los tres elementos están yuxtapuestas.

4. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde (b) es al menos una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia diana de corte de una enzima de restricción.

5. La construcción génica según la reivindicación anterior donde la enzima de restricción da lugar a extremos romos o a

extremos 3’ protuberantes.

6. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la construcción génica es un vector circular.

7. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el tamaño es de entre 4.800 y

10.000 pares de bases (bp) .

8. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el origen de replicación del ADN del bacteriófago φ29 de las secuencias nucleotídicas de (a) y (c) son del mismo extremo del ADN del bacteriófago φ29.

9. La construcción génica según la reivindicación anterior donde el extremo del ADN del bacteriófago φ29 es el izquierdo.

10. La construcción génica según la reivindicación 6 donde el extremo del ADN del bacteriófago φ29 es el derecho.

11. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el origen de replicación del ADN del bacteriófago φ29 de la secuencia nucleotídica de (a) y el origen de replicación del ADN del bacteriófago φ29 de la secuencia nucleotídica de (c) son de extremos distintos del ADN del bacteriófago φ29.

12. La construcción génica según la reivindicación anterior donde un origen de replicación del ADN del bacteriófago φ29 es el izquierdo y el otro origen de replicación del ADN del bacteriófago φ29 es el derecho.

13. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, 11 o 12 donde la secuencia nucleotídica que comprende el origen izquierdo de replicación del ADN del bacteriófago φ29 consiste en entre 68 y 200 nucleótidos del extremo izquierdo del ADN del bacteriófago φ29.

14. La construcción génica según la reivindicación anterior donde la secuencia nucleotídica que comprende el origen izquierdo de replicación del ADN del bacteriófago φ29 consiste en 68 nucleótidos del extremo izquierdo del ADN del bacteriófago φ29.

15. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 a 12 donde la secuencia nucleotídica que comprende el origen derecho de replicación del ADN del bacteriófago φ29 consiste en entre 125 y 250 nucleótidos del extremo derecho del ADN del bacteriófago φ29.

16. La construcción génica según la reivindicación anterior donde la secuencia nucleotídica que comprende el origen derecho de replicación del ADN del bacteriófago φ29 consiste en entre 150 y 200 nucleótidos del extremo derecho del ADN del bacteriófago φ29.

17. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que además comprende al menos un sitio de clonación múltiple.

18. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que además comprende al menos un marcador.

19. La construcción génica según la reivindicación anterior donde el marcador es un gen de resistencia a un antibiótico.

20. La construcción génica según la reivindicación anterior donde el antibiótico es ampicilina o kanamicina.

21. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el punto de corte es la secuencia nucleotídica diana de corte de la enzima de restricción Dra I o Bae I.

22. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o una variante biológicamente equivalente.

23. Uso de la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para la amplificación de una secuencia nucleotídica exógena.

24. Un oligonucleótido que comprende la secuencia nucleotídica que consiste en entre 68 y 130 nucleótidos del extremo izquierdo del ADN del bacteriófago φ29.

25. El oligonucleótido según la reivindicación anterior que comprende la secuencia nucleotídica que consiste en 68 nucleótidos del extremo izquierdo del ADN del bacteriófago φ29.

26. El oligonucleótido según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores donde el extremo 5’ está fosforilado.

27. El oligonucleótido según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores que comprende la secuencia nucleotídica diana de una enzima de restricción, o la secuencia nucleotídica resultante del corte con una enzima de restricción, en posición 3’ respecto de la secuencia nucleotídica que consiste en entre 68 y 130 nucleótidos del extremo izquierdo del ADN del bacteriófago φ29.

28. Uso del oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 para la construcción de una secuencia nucleotídica recombinante lineal donde una secuencia nucleotídica exógena que se quiere amplificar está flanqueada por secuencias nucleotídicas que comprenden la secuencia nucleotídica que consiste en entre 68 y 130 nucleótidos del extremo izquierdo del ADN del bacteriófago φ29.

29. Método de amplificación de ADN que comprende al menos las siguientes etapas:

a) obtener una molécula de ADN lineal que comprende la secuencia de ADN a amplificar flanqueada en ambos extremos por:

i) la secuencia del origen de replicación izquierdo del ADN del bacteriófago φ29, que comprende al menos 68 nucleótidos del extremo izquierdo del ADN del bacteriófago φ29, quedando el extremo terminal de dicho origen en el extremo del ADN lineal, o por

ii) la secuencia del origen de replicación derecho del ADN del bacteriófago φ29, que comprende al menos 68 nucleótidos del extremo derecho del ADN del bacteriófago φ29, quedando el extremo terminal de dicho origen en el extremo del ADN lineal, o por

iii) la secuencia del origen de replicación derecho del ADN del bacteriófago φ29, que comprende al menos 68 nucleótidos del extremo derecho del ADN del bacteriófago φ29, por un lado y la del izquierdo, que comprende al menos 68 nucleótidos del extremo izquierdo del ADN del bacteriófago φ29, por otro, quedando el extremo terminal de dichos orígenes en los dos extremos del ADN lineal;

b) amplificar la secuencia de ADN lineal obtenida en la etapa (a) .

30. El método según la reivindicación anterior donde en la amplificación de la etapa (b) se emplean las proteínas ADN polimerasa, TP, p5 y p6 del bacteriófago φ29 o cualquier variante bioequivalente de dichas proteínas.

31. El método según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores donde la secuencia de ADN a amplificar tiene un tamaño de entre 500 bp y 100.000 bp.

32. El método según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores donde la secuencia de ADN lineal obtenida en la

etapa (a) tiene fosforilados los dos extremos 5’.

33. El método según cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores donde la secuencia del origen de replicación izquierdo del ADN φ29 consiste en entre 68 y 200 nucleótidos del extremo izquierdo del ADN del bacteriófago φ29.

34. El método según la reivindicación anterior donde la secuencia del origen de replicación izquierdo del ADN φ29 consiste en 68 nucleótidos del extremo izquierdo del ADN del bacteriófago φ29.

35. El método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 donde la secuencia del origen de replicación derecho del ADN φ29 consiste en entre 125 y 250 nucleótidos del extremo derecho del ADN del bacteriófago φ29.

36. El método según la reivindicación anterior donde la secuencia del origen de replicación derecho del ADN φ29 consiste en entre 150 y 200 nucleótidos del extremo derecho del ADN del bacteriófago φ29.

37. El método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 donde la secuencia del origen de replicación izquierdo del ADN del bacteriófago φ29 consiste en entre 68 y 200 nucleótidos del extremo izquierdo del ADN del bacteriófago φ29 y la secuencia del origen de replicación derecho del ADN del bacteriófago φ29 consiste en entre 125 y 250 nucleótidos o entre 150 y 200 nucleótidos del extremo derecho del ADN del bacteriófago φ29.

38. El método según cualquiera de las nueve reivindicaciones anteriores donde la etapa (b) se realiza a una temperatura inferior a 30º C, preferiblemente inferior a 27º C, y más preferiblemente entre 20º C y 25º C.

39. El método según cualquiera de las diez reivindicaciones anteriores caracterizado por que en la etapa (a) se emplea la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

40. El método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 38 caracterizado por que en la etapa (a) se emplea el oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27.

41. Kit para la amplificación de una secuencia nucleotídica exógena que comprende al menos una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, al menos un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27 o ambos.

42. El kit según la reivindicación anterior donde la construcción génica consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o una variante biológicamente equivalente..

43. El kit según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores que además comprende la ADN polimerasa, la TP, la proteína de unión a ADN de cadena simple (SSB) y/o la proteína de unión a ADN de cadena doble (DBP) son la ADN

polimerasa, TP, p5 y/o p6 del bacteriófago φ29 o una variante bioequivalente de dichas proteínas.

44. El kit según cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores que además comprende al menos uno de los elementos de la siguiente lista: desoxinucleósidos trifosfato (dNTPs) , (NH4) 2SO4, MgCl2, ditiotreitol (DTT) , glicerol, albúmina de suero bovino (BSA) y tampón Tris-HCl con pH entre 6, 5 y 8.

45. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 46 para la amplificación de una secuencia nucleotídica exógena.

FIG. 1

FIG. 2A

FIG. 2B

FIG. 2C

FIG. 3

FIG. 4A

FIG. 4B

FIG. 5A

FIG. 5B

FIG. 5C

FIG. 6

FIG. 7A FIG. 7B

FIG. 8A

FIG. 8B

FIG. 9A

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FIG. 10A

FIG. 10B

FIG. 11