Sistema mejorado de expresión de proteína.

Un polinucleótido de ADN aislado adecuado para la expresión heteróloga de un polipéptido de interés en una célula de insecto

, comprendiendo dicho polinucleótido de ADN un polinucleótido de ADN promotor que comprende una secuencia funcional de nucleótidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con la SEC ID Nº 68, restos 7-586, teniendo dicha secuencia funcional de nucleótidos actividad promotora en una célula S2 de Drosophila, en el que la secuencia comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 80% con la SEC ID Nº 37 y con actividad promotora en una célula S2 de Drosophila

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2009/057278.

Solicitante: Expres2ion Biotechnologies ApS.

Nacionalidad solicitante: Dinamarca.

Dirección: Agern Allé 1 2970 Hørsholm DINAMARCA.

Inventor/es: RASMUSSEN,PETER BIRK, DYRING,CHARLOTTE, DE JONGH,WILLEM ADRIAAN, LYKKEGAARD,HELENE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/435 (de animales; de humanos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/79 (Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a huéspedes eucariotas)

PDF original: ES-2543730_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Sistema mejorado de expresión de proteína Campo de ¡a invención

La presente invención se refiere al campo de la ingeniería genética y la biología molecular. En particular, la presente Invención se refiere a nuevos pollnucleótidos de ADN promotores y a su uso como herramienta para la expresión mejorada de proteínas en células huésped, notablemente en DrosopMa me/anogasfer. Además, la presente invención se refiere a vectores que contienen el polinucleótido y también al uso de éstos en expresión recombinante de pollpéptldos, en particular expresión heteróloga de proteínas, tales como enzimas industriales o proteínas para uso farmacéutico incluyendo proteínas eucariotas (por ejemplo, de mamífero, tal como humanas, pero también de protozoos o helmintos) y virales. La Invención es pailicularmente relevante en el campo de la expresión de proteínas donde el producto expresado se secreta de células huésped recombinantes, especialmente si estas células huésped son células de insecto.

Antecedentes de ¡a invención

Los sistemas de producción de proteínas, en que los polipéptidos o proteínas de Interés se producen en organismos o células recombinantes, son el eje central de la biotecnología comercial. A los primeros sistemas, basados en expresión bacteriana en huéspedes tales como E. coli, se les han unido los sistemas basados en huéspedes eucariotas, en particular células de mamífero en cultivo, células de insecto tanto en cultivo como en forma de Insectos completos, y mamíferos transgénicos tales como ovejas y cabras.

Los sistemas de cultivo de células procariotas son fáciles de mantener y baratos de manejar. Sin embargo, las células procariotas no tienen capacidad de modificación post-traduccional de proteínas eucariotas. Además, muchas proteínas se pliegan de forma Incorrecta, lo que requiere procedimientos específicos para replegarlas, que aumenta los costes de producción.

Se han descrito sistemas de cultivo de células eucariotas para varias aplicaciones. Por ejemplo, las células de mamífero tienen capacidad de modificación post-traduccional, y generalmente producen proteínas que se pliegan correctamente y sin solubles. Las desventajas principales de los sistemas de células de mamífero incluyen la necesidad de Instalaciones de cultivo especializadas y caras, el riesgo de Infección, que puede conducir a pérdida del cultivo completo, y el riesgo de contaminar el producto final con proteínas de mamífero potencialmente peligrosas.

También se usan células de insecto para la expresión de polipéptidos. El sistema de expresión más extendido usado en células de insecto se basa en vectores de baculovirus. Un vector de expresión de baculovirus se construye remplazando el gen de la polihedrina de baculovirus, que codifica una proteína estructural principal del baculovirus, con un gen heterólogo, bajo el control del promotor nativo fuerte de la polihedrina. Las células huésped de insecto cultivadas se infectan con el virus recombinante, y la proteína producida de ese modo puede recuperarse de las propias células o del medio de cultivo si se emplean señales de secreción adecuadas. Estos sistemas también sufren, sin embargo, de problemas asociados con la reproducibilidad del nivel y calidad de expresión, la infección del cultivo, y pueden requerir instalaciones de cultivo especializadas. Además, las reservas de baculovirus, que para la producción de ciertas proteínas pueden tener que prepararse en condiciones de GMP, no siembre son estables con el paso del tiempo.

Los promotores adecuados usados en células S2 de DrosopMa me/anogasfer para la expresión de proteínas también incluyen el promotor pMT y el P2ZOp2F (promotor OPIE2).

Chung y col. Molecular and Cellular Biology, Vol. 10, N° 12, 1992 se refiere a la caracterización de elementos reguladores positivos y negativos en el promotor distal de Actina5C.

Angelichio y col. Nucleic Acids Research, Vol. 19, N° 18 5037-5043, 1991 se refiere a una comparación de varios promotores y señales de poliadenilación para su uso en expresión de genes heterólogos en células cultivadas de Drosophila.

Un objeto de la presente invención es proporcionar una expresión y/o secreción más eficaz en células huésped, notablemente en Drosopñ/Za me/anogasfer. Un objeto adicional es proporcionar polinucleótidos y vectores que faciliten esta expresión y secreción eficaces.

Sumario de ia invención

En un aspecto amplio, la presente invención se refiere a polinucleótidos de ADN promotores, adecuados para su uso en la expresión heteróloga de un polipéptido de interés. En otro aspecto amplio, la presente invención se refiere a un polinucleótido de ADN aislado, un llamado vector de expresión, que comprende dichos polinucleótidos de ADN promotores adecuados para la expresión y producción de cantidades relativamente altas de una proteína de interés, tal como proteínas terapéuticamente eficaces o enzimas industriales.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido de ADN aislado adecuado para la expresión heteróloga de un polipéptido de interés en una célula de Insecto, comprendiendo dicho polinucleótido de ADN

un polinucleótido de ADN promotor que comprende una secuencia funcional de nucleótidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con la SEC ID N° 68, restos 7-586, teniendo dicha secuencia funcional de nucleótidos actividad promotora en una célula S2 de Drosophila, en el que la secuencia comprende una secuencia con una Identidad de secuencia de al menos el 80% con la SEC ID N° 37 y con actividad promotora en una célula S2 de Drosophila.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una célula que comprende el polinucleótido aislado de la Invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de un polipéptido de Interés codificado por un polinucleótido, comprendiendo el procedimiento las etapas de

(a) obtener una secuencia pollnucleotídica que codifica el polipéptido de interés;

(b) insertar la secuencia pollnucleotídica que codifica el polipéptido de interés en el polinucleótido aislado de la Invención.

(c) transformar una célula huésped con el polinucleótido obtenido en la etapa (b);

(d) permitir la expresión del polinucleótido obtenido en la etapa (b) para producir el polipéptido; y (e) obtener el polipéptido a partir de la misma.

Breve descripción de ias figuras

Flg. 1: Nivel normalizado de expresión de proteínas en comparación con el promotor pOPIE2 en el vector p2ZOP2F para diferentes transfecciones de un promotor Actin5C mutante para transformaciones estables y transitorias. (b)..(d) se refiere a transfecciones diferentes usando el plásmido pHP11 que contiene el promotor de Actina5C mutante.

Fig. 2: Nivel de expresión del promotor de FISP70 de longitud completa y truncado durante la expresión transitoria. Se usó pOPIE2 como control en el experimento.

Fig. 3: Nivel de producción de RANKL para líneas celulares estables usando seis diferentes promotores para dirigir la expresión de proteínas. Éstos Incluyen tres versiones del promotor de Actina5C mutado (el promotor de longitud completa, (2) una versión truncada (vector pHP17) y (3) la versión de truncamiento más corta de 612 pb), dos versiones del promotor de FISP70 (el promotor de HSP70 truncado y el promotor central de FISP70) y el promotor pOPIE2 como control.

Fig. 4: Niveles normalizados de expresión conseguidos durante la transfección transitoria. Éstos incluyen tres versiones del promotor de Actina5C mutado (el promotor de longitud completa, (2) una versión truncada (vector pFIP17) y (3) la... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un polinucleótido de ADN aislado adecuado para la expresión heteróloga de un polipéptido de interés en una célula de insecto, comprendiendo dicho polinucleótido de ADN un polinucleótido de ADN promotor que comprende una secuencia funcional de nucleótidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con la SEC ID N° 68, restos 7-586, teniendo dicha secuencia funcional de nucleótidos actividad promotora en una célula S2 de Drosophila, en el que la secuencia comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 80% con la SEC ID N° 37 y con actividad promotora en una célula S2 de Drosophila.

2. El polinucleótido de ADN aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido de ADN promotor comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEC ID N° 37 y la SEC ID N° 68 con o sin secuencias flanqueantes de sitio de restricción en cualquiera de los extremos.

3. El polinucleótido de ADN aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido de ADN promotor comprende un nucleótido que es un fragmento funcional de al menos 80 nucleótidos contiguos de la SEC ID N° 37 o la SEC ID N° 68, teniendo dicho fragmento funcional actividad promotora en una célula S2 de Drosophila.

4. El polinucleótido de ADN aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la identidad de secuencia con la SEC ID N° 37 o la SEC ID N° 68 es de al menos el 85%, tal como al menos el 90%, tal como al menos el 95%, y tal como al menos el 98%.

5. El polinucleótido de ADN aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende la SEC ID N° 68, restos 7-586.

6. El polinucleótido de ADN aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho polinucleótido de ADN promotor muestra un nivel de expresión de proteínas aumentado en comparación con el nivel de expresión de proteínas de uno cualquiera de los polinucleótidos de ADN promotores que tienen la secuencia de la SEC ID N° 1 o la SEC ID N° 4.

7. El polinucleótido de ADN aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende adicionalmente

a) un marcador de selección, tal como un marcador de selección seleccionado entre el grupo que consiste en un marcador de selección de Zeocina, un marcador de selección de Neomicina, un marcador de selección de Higromicina, un marcador de selección de Puromicina, y un marcador de selección de Blasticidina, y/o

b) un promotor bacteriano, tal como el promotor bacteriano pKANR, y/o

c) un segundo polinucleótido de ADN promotor adecuado para dirigir la expresión del marcador de selección en una célula de insecto, y/o

d) al menos un elemento ubicuo de abertura de la cromatina cadena arriba y/o cadena abajo respecto a un sitio de clonación múltiple, y/o

e) al menos un elemento de aislamiento transcripcional, tal como la secuencia de aislamiento Gypsy (gsu(Hw)), y/o

f) una secuencia codificante de dihidrofolato reductasa (dhfr) adecuada para la selección en células de insecto, y/o

g) al menos una secuencia señal de poliadenilación tal como la secuencia poliA de SV40 y/o una señal poliA de OPIE2, y/o

h) un origen de replicación de Eco//, y/o

i) al menos una secuencia polinucleotídica señal de exportación de proteínas, tal como una seleccionada entre la lista que consiste en BIP y CPY, y/o

j) al menos una secuencia de marca HIS, y/o

k) un sitio de clonación múltiple cadena abajo de dicho polinucleótido de ADN promotor para la inserción de un gen que codifica un polipéptido de interés en dicho polinucleótido de ADN aislado, y/o

l) al menos un elemento de 72 pb de SV40, y/o

m) al menos un elemento de control de amplificación, y/o

n) al menos un elemento Ori-beta, y/o

o) al menos un elemento de reglón de unión a matriz (MAR), y/o

p) al menos un elemento PRE del virus de la Hepatitis B, tal como un elemento PRE del virus de la Hepatitis B de acuerdo con la SEC ID N° 40, tal como los nucleótldos 10 a 574 de la SEC ID N° 40, y/o

q) al menos un ¡ntrón, tal como el ¡ntrón mostrado en la SEC ID N° 60 Incluyendo o excluyendo los sitios de restricción flanqueantes, cadena abajo de la secuencia polinucleotídlca de ADN promotor y cadena arriba de un sitio de clonación múltiple, y/o

r) al menos una secuencia polinucleotídlca que codifica un pollpéptldo heterólogo a dicha secuencia polinucleotídlca de ADN promotor.

8. El pollnucleótldo de ADN aislado de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho segundo promotor definido en la opción c) es seleccionado entre el grupo que consiste en

(I) una secuencia de nucleótldos de la SEC ID N° 1, SEC ID N° 2, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6, SEC ID N° 33, SEC ID N° 36, SEC ID N° 37, o una secuencia de nucleótidos que comprende los restos 7-586 de la SEC ID N° 68;

(¡I) una secuencia funcional de nucleótldos con una Identidad de secuencia de al menos el 80% con una secuencia cualquiera de (I) y que tiene actividad promotora en una célula S2 de Drosophila;

(¡II) un nucleótldo que es un fragmento funcional de al menos 80 nucleótidos contiguos de una secuencia cualquiera de (I) o (¡I), teniendo dicho fragmento funcional actividad promotora en una célula S2 de Drosophila;

(¡v) una secuencia funcional de nucleótldos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con dicho fragmento funcional de (¡II) y que tiene actividad promotora en una célula S2 de Drosophila;

(v) una primera secuencia quimérica de nucleótldos que comprende dos o más secuencias de una secuencia cualquiera de (I), (¡I), (iil) y (¡v), y

(vi) una segunda secuencia quimérica de nucleótidos que tiene actividad promotora en una célula S2 de Drosophila, que comprende al menos 80 nucleótldos y que incluye tramos de nucleótidos consecutivos de al menos 2 secuencias de nucleótldos de (¡II) y/o (¡v), en el que cada uno de dichos tramos consecutivos en solitario no tiene actividad promotora en una célula S2 de Drosophila.

9. El pollnucleótldo de ADN aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que está esencialmente libre de ADN viral.

10. El pollnucleótldo de ADN aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la secuencia polinucleotídlca de ADN promotor controla la expresión de un gen u otra secuencia de ADN a la cual está unida.

11. El pollnucleótldo de ADN aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que está adaptado para clonación independiente de ligamiento (LIC).

12. El pollnucleótldo de ADN aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho pollnucleótldo de ADN promotor comprende una secuencia quimérica en la que la secuencia de nucleótldos SEC ID N° 36, que está contenida en una secuencia de nucleótldos que comprende la SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, SEC ID N° 6 o SEC ID N° 33, está remplazada por la secuencia de nucleótldos SEC ID N°37

13. Una célula que comprende el pollnucleótldo de ADN aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, tal como una célula que está transfectada de forma estable con dicho pollnucleótldo de ADN aislado.

14. La célula de acuerdo con la reivindicación 13, que es una célula de Insecto, tal como una célula de DrosopMa me/anogasfer.

15. Un procedimiento para la producción de un pollpéptldo de Interés codificado por un pollnucleótldo, comprendiendo el procedimiento las etapas de

(a) obtener una secuencia polinucleotídlca que codifica el pollpéptldo de Interés;

(b) Insertar dicha secuencia polinucleotídlca que codifica el pollpéptldo de Interés en el pollnucleótldo de ADN aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12;

(c) transformar una célula huésped con el pollnucleótldo obtenido en la etapa (b);

(d) permitir la expresión de dicho polinucleótido obtenido en la etapa (b) para producir el polipéptido; y

(e) obtener el polipéptido a partir de la misma.