Producción mejorada de lípidos que contienen ácidos grasos polienoicos por cultivos de alta densidad de microbios eucariotas en fermentadores.

Un procedimiento para producir lípidos microbianos eucariotas que comprende:

(a) cultivar microorganismos eucariotas del orden Thraustochytriales en un medio de fermentación para aumentar la densidad de biomasa de dicho medio de fermentación a al menos 100 g/l sobre una base de peso seco celular;

(b) proporcionar condiciones de fermentación suficientes para permitir que dichos microorganismos produzcan dichos lípidos y

(c) recuperar dichos lípidos, en los que más del 15% de dichos lípidos son lípidos poliinsaturados.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10012187.

Solicitante: DSM IP ASSETS B.V..

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: HET OVERLOON 1 6411 TE HEERLEN PAISES BAJOS.

Inventor/es: BARCLAY, WILLIAM, R., BAILEY, RICHARD, B., DIMASI,DON, HANSEN,JON,M, MIRRASOUL,PETER,J, KANEKO,TATSUO, RUECKER,CRAIG,M, VEEDER,GEORGE,T.,III.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N1/00 (Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > ALIMENTOS O PRODUCTOS ALIMENTICIOS; SU TRATAMIENTO,... > ALIMENTOS, PRODUCTOS ALIMENTICIOS O BEBIDAS NO ALCOHOLICAS... > Alimentos o productos alimenticios; Su preparación... > A23L1/03 (que contienen aditivos (A23L 1/05, A23L 1/30, A23L 1/308 tienen prioridad))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos orgánicos que contienen... > C12P7/64 (Grasas; Aceites; Ceras de tipo éster; Acidos grasos superiores, es decir, con una cadena lineal de al menos siete átomos de carbono unida a un grupo carboxilo; Aceites o grasas oxidadas)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > ALIMENTOS O PRODUCTOS ALIMENTICIOS; SU TRATAMIENTO,... > ACEITES O GRASAS COMESTIBLES, p. ej. MARGARINAS,... > A23D9/00 (Otros aceites o grasas comestibles, p. ej. aceites para cocinar)

PDF original: ES-2545492_T3.pdf

 

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Producción mejorada de lípidos que contienen ácidos grasos polienoicos por cultivos de alta densidad de microbios eucariotas en fermentadores.

Fragmento de la descripción:

Producción mejorada de lípidos que contienen ácidos grasos polienoicos por cultivos de alta densidad de microbios eucariotas en fermentadores.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para cultivar microorganismos y recuperar lípidos microbianos. En particular, la presente invención se refiere a producir lípidos poliinsaturados microbianos.

Antecedentes de la invención Se ha creído en general que la producción de ácidos grasos polienoicos (ácidos grasos que contienen 2 o más enlaces carbono-carbono insaturados) en microorganismos eucariotas requiere la presencia de oxígeno molecular (es decir, condiciones aerobias) . Esto es debido a que se cree que el doble enlace cis formado en los ácidos grasos de todos los microorganismos eucariotas no parasitarios implica una reacción de desaturación dependiente de oxígeno, directa, (sistemas de desaturasa microbiana oxidativa) . Otros lípidos microbianos eucariotas que se sabe que requieren oxígeno molecular incluyen esteroles fúngicos y vegetales, oxicarotenoides (es decir, xantofilas) , ubiquinonas y compuestos preparados a partir de cualquiera de estos lípidos (es decir, metabolitos secundarios) .

Se ha demostrado que algunos microbios eucariotas (tales como algas; hongos, incluyendo levaduras y protistas) son buenos productores de ácidos grasos polienoicos en fermentadores. Sin embargo, el cultivo de muy alta densidad (mayor que aproximadamente 100 g/l de biomasa microbiana, especialmente a escala comercial) puede conducir a contenidos disminuidos en ácidos grasos polienoicos y por lo tanto productividad disminuida de ácidos grasos polienoicos. Esto puede ser debido en parte a diversos factores incluyendo la dificultad de mantener altos niveles de oxígeno disuelto debido a la alta demanda de oxígeno desarrollada por la alta concentración de microbios en el caldo de fermentación. Los métodos para mantener mayor nivel de oxígeno disuelto incluyen aumentar la velocidad de aireación y/o usar oxígeno puro en vez de aire para aireación y/o aumentar la velocidad con que se remueve en el fermentador. Estas soluciones generalmente aumentan el coste de la producción de lípidos y el coste de capital del equipo de fermentación y pueden producir problemas adicionales. Por ejemplo, la aireación aumentada puede conducir fácilmente a graves problemas de formación de espuma en el fermentador a altas densidades de células y el mezclamiento aumentado puede conducir a ruptura celular microbiana debido a fuerzas de cizallamiento aumentadas en el caldo de fermentación (esto produce que los lípidos se liberen en el caldo de fermentación donde pueden llegar a oxidarse y/o degradarse mediante enzimas) . La ruptura celular microbiana es un problema aumentado en las células que han experimentado limitación o agotamiento de nitrógeno para inducir la formación de lípidos, dando como resultado paredes celulares más débiles.

Como resultado, cuando se cultivan microbios eucariotas productores de lípidos a concentraciones celulares muy altas, sus lípidos contienen en general sólo cantidades muy pequeñas de ácidos grasos polienoicos. Por ejemplo, la levadura Lipomyces starkeyi se ha cultivado a una densidad de 153 g/l con concentración de lípidos resultantes de 83 g/l en 140 horas usando alcohol como fuente de carbono. Sin embargo, el contenido en ácidos grasos polienoicos de la levadura a una concentración mayor que 100 g/l dio como promedio sólo 4, 2% de ácidos grasos totales (bajando desde una alta de 11, 5% de ácido graso total a una densidad celular de 20-30 g/l) . Yamauchi et al., J. Ferment. Technol, 1.983, 61, 275-280. Esto da como resultado una concentración de ácidos grasos polienoicos de sólo aproximadamente 3, 5 g/l y una productividad de ácidos grasos polienoicos promedio de sólo aproximadamente 0, 025 g/l/h. Adicionalmente, el único ácido graso polienoico indicado en los lípidos de levaduras fue C18:2.

Se ha demostrado que otra levadura, Rhodotorula glutinus, presenta una productividad de lípidos promedio de aproximadamente 0, 49 g/l/h, pero también un contenido en ácidos grasos polienoicos total bajo en sus lípidos (15, 8% de ácidos grasos totales, 14, 7% de C18:2 y 1, 2% de C18:3) dando como resultado una productividad de ácidos grasos polienoicos en un cultivo discontinuo alimentado de sólo aproximadamente 0, 047 g/l/h y 0, 077 g/l/h en cultivo continuo.

Uno de los presentes autores ha demostrado previamente que algunas microalgas marinas en el orden Thraustochytriales pueden ser excelentes productores de ácidos grasos polienoicos en fermentadores, especialmente cuando se cultivan a niveles de baja salinidad y especialmente a niveles de cloruro muy bajos. Otros han descrito que Thraustochytrids presenta una productividad de ácidos grasos polienoicos promedio (DHA, C22: 6n-3 y DPA, C22:5n-6) de aproximadamente 0, 158 g/l/h, cuando se cultiva a densidad celular de 59 g/l en 120 horas. Sin embargo, esta productividad sólo se consiguió a una salinidad de aproximadamente 50% de agua de mar, una concentración que produciría una seria corrosión en fermentadores de acero inoxidable convencionales.

La patente internacional WO 94/08467 indica un procedimiento para cultivar la microflora Thraustochytrium, Schizochytrium y mezclas de los mismos, que incluye el cultivo de la microflora en un medio de fermentación que contiene sales sódicas que no contienen cloruro. La mayor densidad de biomasa conseguida por el procedimiento descrito es 21, 7 g/l.

Lena Hansson et al., Appl. Microbiol Biotechnol (1.986) 24: 12-18 describe la influencia de las condiciones de cultivo sobre la producción de lípidos por la levadura Cr y ptococcus albidus. La mayor densidad conseguida por el 2 5

procedimiento descrito es aproximadamente 27 g/l.

Lena Hansson et al., Appl. Microbiol Biotechnol (1.986) 24 : 187 -192 describen formación de lípidos por la levadura Cr y ptococcus albidus en cultivos de quimiostatos limitados en nitrógeno y en limitados en carbono. Se describe que las densidades de biomasa varían entre 10-18 g/l.

La patente europea EP 0 823 475 A1 describe que la cepa SR21 del género Schizochytrium y un microorganismo pertenecen a la misma especie y un procedimiento para preparar la serie (n-3) de ácido docosahexaenoico y/o la serie (n-6) de ácido docosapentaenoico usando dichos microorganismos.

La patente internacional WO 98/03671 describe un procedimiento para preparar lípidos que contienen ácido docosahexaenoico (DHA) y/o ácido docosapentaenoico (DPA) (ambos por sus siglas en inglés) cultivando microorganismos y un microorganismo pertenece al género Ulkenia con la capacidad para producir los lípidos.

Los costes de producción de lípidos microbianos que contienen ácidos grasos polienoicos y especialmente los ácidos grasos altamente insaturados, tales como C18:4n-3, C20:4n-6, C20:5n3, C22:5n-3, C22:5n-6 y C22:6n-3, han permanecido altos en parte debido a las densidades limitadas a las que se han cultivado los microbios eucariotas que contienen alto contenido en ácidos grasos polienoicos y la disponibilidad limitada de oxígeno ambas a estas altas concentraciones celulares y las mayores temperaturas necesarias para conseguir alta productividad.

Por lo tanto, hay una necesidad de un procedimiento para cultivar microorganismos a alta concentración que facilite aún la producción aumentada de lípidos conteniendo ácidos grasos polienoicos.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un procedimiento para producir lípidos microbianos eucariotas que comprende:

(a) cultivar microorganismos eucariotas del orden Thraustochytriales en un medio de fermentación para aumentar la densidad de biomasa de dicho medio de fermentación a al menos 100... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para producir lípidos microbianos eucariotas que comprende:

(a) cultivar microorganismos eucariotas del orden Thraustochytriales en un medio de fermentación para aumentar la densidad de biomasa de dicho medio de fermentación a al menos 100 g/l sobre una base de peso seco celular;

(b) proporcionar condiciones de fermentación suficientes para permitir que dichos microorganismos produzcan dichos lípidos y

(c) recuperar dichos lípidos, en los que más del 15% de dichos lípidos son lípidos poliinsaturados.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que un nivel de oxígeno disuelto en dicho medio de fermentación durante dicha etapa de crecimiento de microorganismos es mayor que el nivel de oxígeno disuelto en el medio de fermentación durante dicha etapa de producción de lípidos.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el nivel de oxígeno disuelto en dicho medio de fermentación durante la etapa de crecimiento de los microorganismos es al menos 4% de saturación.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el nivel de oxígeno disuelto en dicho medio de fermentación durante la etapa de producción de lípidos es menor que 1% de saturación.

5. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que al comienzo de la fermentación el oxígeno disuelto está en, o cerca de, saturación y, a medida que crecen los microorganismos, se deja que se desvíe hasta 3% de saturación o menos.

6. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que al comienzo de la fermentación el oxígeno disuelto está en, o cerca de, saturación y, a medida que crecen los microorganismos, se deja que se desvíe hasta 1 % de saturación o menos.

7. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que dichos microorganismos se seleccionan del grupo que consiste en Thraustochytrium, Schizochytrium y mezclas de los mismos.

8. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que los microorganismos son Schizochytrium.

9. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que la cantidad total de ácidos grasos omega-3 y omega-6 es al menos 20% de dichos lípidos microbianos.

10. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos 40% de los lípidos son ácidos grasos poliinsaturados omega-3 y/u omega-6.

11. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos 50% de los lípidos son ácidos grasos poliinsaturados omega-3 y/u omega-6.

12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que al menos 25% de dichos lípidos microbianos es ácido docosahexaenoico.

13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que al menos 30% de los lípidos es ácido docosahexaenoico.

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que al menos 40% de los lípidos es ácido docosahexaenoico.

15. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el régimen de producción de ácido graso omega-3 promedio es al menos 0, 2 g de ácido graso omega-3 /l/h.

16. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el régimen de producción de ácido graso omega-3 promedio es al menos 0, 4 g de ácido graso omega-3 /l/h.

17. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el régimen de producción de ácido graso omega-3 promedio es al menos 0, 5 g de ácido graso omega-3 /l/h.

18. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho procedimiento produce ácido docosahexaenoico a una velocidad promedio de al menos 0, 2 g/l/h.

19. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el régimen de producción de ácido docosahexaenoico promedio es al menos 0, 4 g de ácido docosahexaenoico /l/h.

20. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el régimen de producción de

ácido docosahexaenoico promedio es al menos 0, 5 g de ácido docosahexaenoico /l/h. 17

21. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de crecimiento de microorganismos comprende añadir una fuente de carbono y una fuente de nutriente limitante.

22. El procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicha fuente de carbono no es alcohol.

23. El procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicha fuente de carbono comprende un carbohidrato.

24. El procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicha fuente de nutriente limitante comprende una fuente de nitrógeno.

25. El procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicha fuente de nitrógeno comprende una sal de amonio inorgánica.

26. El procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicha fuente de nitrógeno comprende hidróxido de amonio.

27. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que dichos microorganismos se cultivan en un procedimiento alimentado discontinuo.

28. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que dicho procedimiento produce lípidos a una velocidad promedio de al menos 0, 5 g/l/h.

29. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que el procedimiento proporciona un régimen de producción de lípidos promedio de al menos 0, 7 g/l/h.

30. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que el procedimiento proporciona un régimen de producción de lípidos promedio de al menos 1, 0 g/l/h.

31. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, que comprende cultivar microorganismos eucariotas en un medio de fermentación para aumentar la densidad de biomasa de dicho medio de fermentación a al menos 150 g/l sobre una base de peso celular seco y proporcionar condiciones de fermentación suficientes para permitir que dichos microorganismos produzcan dichos lípidos.

32. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, que comprende cultivar microorganismos eucariotas en un medio de fermentación para aumentar la densidad de biomasa de dicho medio de fermentación a al menos 170 g/l sobre una base de peso celular seco y proporcionar condiciones de fermentación suficientes para permitir que dichos microorganismos produzcan dichos lípidos.

33. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, que comprende cultivar microorganismos eucariotas en un medio de fermentación para aumentar la densidad de biomasa de dicho medio de fermentación a al menos 200 g/l sobre una base de peso celular seco y proporcionar condiciones de fermentación suficientes para permitir que dichos microorganismos produzcan dichos lípidos.

34. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que los lípidos contienen lípidos poliinsaturados en una cantidad mayor que 25%.

35. El procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que los lípidos contienen lípidos poliinsaturados en una cantidad mayor que 35%.