Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas.

Un método para producir una célula eucariota genéticamente modificada que incluye una secuencia exógena insertada en un cromosoma de dicha célula eucariota, que comprende:

transfectar una célula eucariota con uno o más ácidos nucleicos que incluyen

(i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una meganucleasa, y

(ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que incluye dicha secuencia exógena;

en el que dicha meganucleasa produce un sitio de escisión en dicho cromosoma y dicha secuencia exógena se inserta en dicho cromosoma en dicho sitio de escisión;

en el que dicha meganucleasa comprende un polipéptido que tiene al menos un 85 % de similitud de secuencia con los restos 6-160 de la meganucleasa 1-Msol de SEC ID Nº: 6; y

en el que dicha meganucleasa tiene especificidad por un semisitio de secuencia de reconocimiento que difiere en al menos un par de bases de un semisitio dentro de una secuencia de reconocimiento de meganucleasa 1-Msol seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 7 y SEC ID Nº: 8;

en el que:

(1) se ha alterado la especificidad en la posición -1:

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K75, Q77, A49, C49 y K79;

(b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en C77, L77 y Q79, o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K77, R77, E49 y E79; y/o

(2) se ha alterado la especificidad en la posición -2:

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en Q75, K81, C47, 147 y L47;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E75, D75, R47, K47, K81 y R81; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K75, E47 y E81; yo

(3) se ha alterado la especificidad en la posición -3:

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en Q72, C26, L26, V26, A26 y L26;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E72, Y72, H26, K26 y R26; o

(c) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K72, Y72 y H26; y/o

(4) se ha alterado la especificidad en la posición -4:

(a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K28, K83 y Q28;

(b) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R83 y K82, o

(c) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K28 y Q83; y/o

(5) se ha alterado la especificidad en la posición -5:

(a) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R45 y E28;

(b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación que comprende Q28; o

(c) a una C en una hebra sentido mediante una modificación que comprende R28; y/o (6) se ha alterado la especificidad en la posición -6:

(a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K43, V85, L85 y Q30;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E43, E85, K30 y R30; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R43, K43, K85, R85, E30 y D30; y/o

(7) se ha alterado la especificidad en la posición -7:

(a) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E32 y E41;

(b) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R32, R41 y K41;

(c) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K32, M41, L41 e I41; y/o

(8) se ha alterado la especificidad en la posición -8:

(a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K32 y K35;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación que comprende E32; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación que consiste en K32, K35 y R35; y/o (9) se ha alterado la especificidad en la posición -9;

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en N34 y H34;

(b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en S34, C34, V34, T34 y A34; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K34, R34 y H34,

en la que la meganucleasa recombinante no comprende los restos 6-160 de la meganucleasa I-Msol de SEC ID Nº: 6 con solo el par de modificaciones L28 y R83; y

con la condición de que la célula no sea una célula germinal humana o una célula embrionaria humana.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10191904.

Solicitante: Precision Biosciences.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 302 East Pettigrew Street, Dibrell Building, Suite A-100 Durham, North Carolina 27701 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: HELLINGA,HOMME,W, Smith,James Jefferson, Jantz,Derek.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/90 (Introducción estable de ADN extraño en el cromosoma)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/22 (Ribonucleasas)

PDF original: ES-2533370_T3.pdf

 

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Ilustración 1 de Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas.
Ilustración 2 de Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas.
Ilustración 3 de Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas.
Ilustración 4 de Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas.
Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas.

Fragmento de la descripción:

Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas Apoyo gubernamental

La invención fue apoyada en parte por las subvenciones 2R01-GM-0498712, 5F32-GM072322 y 5 DP1 OD000122 del National Institute of General Medical Sciences de los National Institues of Health de los Estados Unidos de América. Por lo tanto, el Gobierno de los Estados Unidos tiene determinados derechos sobre la invención.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la biología molecular y de tecnología de ácidos nucleicos recombinantes. En particular, la invención se refiere a meganucleasas de origen no natural diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia de reconocimiento de ADN alterada y/o afinidad alterada. La invención también se refiere a métodos para producir tales meganucleasas y métodos para producir ácidos nucleicos recombinantes y organismos que usan tales meganucleasas.

Antecedentes de la invención

La ingeniería genómica requiere la capacidad de insertar, suprimir, sustituir y manipular de otro modo secuencias genéticas específicas dentro de un genoma y tiene numerosas aplicaciones terapéuticas y biotecnológicas. El desarrollo de medios eficaces para modificación del genoma sigue siendo un objetivo importante en la terapia génica, agrotecnología y biología sintética (Porteus et al (2005), Nat. Biotechnol. 23:967-73; Tzfira et al (2005), Trends Biotechnol. 23:567-9; McDaniel et al (2005), Curr. Opin. Biotechnol. 16:476-83). Un método habitual para insertar o modificar una secuencia de ADN implica introducir una secuencia de ADN transgénico flanqueada por secuencias homologas a la diana genómica y seleccionar o explorar con respecto a un acontecimiento de recombinación homologa exitoso. La recombinación con el ADN transgénico se produce en pocas ocasiones pero puede estimularse por una rotura de doble cadena en el ADN genómico en el sitio diana. Se han empleado numerosos métodos para crear roturas de doble cadena de ADN, incluyendo irradiación y tratamientos químicos. Aunque estos métodos estimulan eficazmente la recombinación, las roturas de doble cadena se dispersan de forma aleatoria en el genoma, lo que puede ser altamente mutagénico y tóxico. En la actualidad, la incapacidad de dirigir modificaciones génicas a sitios únicos dentro de un fondo cromosómico es un impedimento importante para la ingeniería genómica exitosa.

Un enfoque para conseguir este objetivo es estimular la recombinación homologa en una rotura de doble cadena en un locus diana usando una nucleasa con especificidad para una secuencia que es suficientemente grande para estar presente solamente en un sitio sencillo dentro del genoma (véase, por ejemplo, Porteus et al {2005), Nat. Biotechnol. 23:967-73). La eficacia de esta estrategia se ha demostrado en diversos organismos usando fusiones quiméricas entre un dominio de unión de ADN de dedo de cinc obtenido por ingeniería genética y el dominio de nucleasa no específico de la enzima de restricción Fokl (Porteus (2006), Mol Ther 13:43846; Wright et al (2005), Plant J. 44:693-705; Umov et al (2005), Nature 435:646-51). Aunque estas nucleasas de dedos de cinc artificiales estimulan la recombinación específica de sitio, conservan actividad de escisión no específica residual resultante de la baja regulación del dominio nucleasa y escinden frecuentemente en sitios no pretendidos (Smith et al. (2000), Nucleic Acids Res. 28:3361-9). Tal escisión no pretendida puede provocar mutaciones y toxicidad en el organismo tratado (Porteus et al (2005), Nat. Biotechnol. 23:967-73).

Un grupo de nucleasas de origen natural que reconocen sitios de escisión de 15-40 pares de bases habitualmente hallados en los genomas de plantas y hongos puede proporcionar una alternativa de ingeniería genómica menos tóxica. Tales meganucleasas o endonucleasas de búsqueda se asocian frecuentemente con elementos de ADN parasitarios, tales como intrones de auto-corte y empalme de grupo 1 e inteínas. Promueven de forma natural la recombinación homologa o inserción génica en localizaciones específicas en el genoma hospedador produciendo una rotura de doble cadena en el cromosoma, que recluta la maquinaria de reparación de ADN celular (Stoddard (2006), Q. Rev. Biophys. 38:49-95). Las meganucleasas se agrupan habitualmente en cuatro familias: la familia LAGLIDADG, la familia GIY-YIG, la familia de caja His-Cys y la familia HNH. Estas familias se caracterizan por motivos estructurales, que afectan a la actividad catalítica y secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, los miembros de la familia LAGLIDADG se caracterizan porque tienen una o dos copias del motivo LAGLIDADG conservado (véase Chevalier et al (2001), Nucleic Acids Res 29(18): 3757-3774). Las meganucleasas LAGLIDADG con una copia sencilla del motivo LAGLIDADG forman homodímeros, mientras que los miembros con dos copias del motivo LAGLIDADG se encuentran como monómeros. De forma similar, los miembros de la familia GIY-YIG tienen un módulo GIY-YIG, que es de 70-100 restos de longitud e incluye cuatro o cinco motivos de secuencia conservados con cuatro restos invariantes, dos de los cuales se requieren para actividad (véase Van Roey ef al (2002), Nature Struct. Biol. 9:806-811). Las meganucleasas de caja His-Cys se caracterizan por una serie altamente conservada de histidinas y cisternas sobre una región que abarca varios cientos de restos de aminoácidos (véase Chevalier et al (2001), Nucleic Acids Res 29(18): 3757-3774). En el caso de la familia NHN, los miembros se definen por motivos que contiene dos pares de histidinas conservadas rodeadas por restos de asparagina (véase Chevalier et al (2001), Nucleic Acids Res 29(18): 3757-3774). Las cuatro familias de meganucleasas están ampliamente separadas entre sí con respecto a elementos estructurales

conservados y, en consecuencia, la especificidad de secuencia de reconocimiento de ADN y actividad catalítica.

Se han usado meganucleasas naturales, principalmente de la familia LAGLIDADG, para promover de forma eficaz la modificación genómica específica de sitio en plantas, levaduras, Drosophila, células de mamífero y ratones, pero este enfoque se ha limitado a la modificación de genes homólogos que conservan la secuencia de reconocimiento de meganucleasa (Monnat et al (1999), Biochem. Biophys. Res Commun. 255:88-93) o genomas previamente modificados por ingeniería genética en los que se ha introducido una secuencia de reconocimiento (Rouet etal(1994), Mol Cell. Biol. 14:8096-106; Chilton ef al (2003), Plant Physiol. 133:956 65; Puchta et al (1996), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:5055-60; Rong ef al (2002), Genes Dev 16:1568-81; Gouble et al (2006), J. Gene Med. 8(5):616-622).

La implementación sistemática de modificación génica estimulada por nucleasas requiere el uso de enzimas modificadas por ingeniería genética con especificidades adaptadas para dirigir roturas de ADN a sitios existentes en un genoma y, por lo tanto, ha habido gran interés en la adaptación de meganucleasas para promover las modificaciones génicas en sitios médica o biotecnológicamente relevantes (Porteus etal{2005), Nat. Biotechnol. 23:967-73; Sussman et al (2004), J. Mol. Biol. 342:31-41; Epinat ef al (2003), Nucleic Acids Res 31:2952-62).

La meganucleasa l-Crel de Chlamydomonas reinhardtiies un miembro de la familia LAGLIDADG que reconoce y corta una secuencia de reconocimiento de 22 pares de bases en el cromosoma de cloroplastos y que presenta una diana atractiva para rediseño de meganucleasas. La enzima de tipo silvestre es un homodímero en el que cada monómero entra en contacto directo con 9 pares de bases en la secuencia de reconocimiento de longitud completa. Se han usado técnicas de selección genética para identificar mutaciones en l-Crel que alteran... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para producir una célula eucariota genéticamente modificada que incluye una secuencia exógena insertada en un cromosoma de dicha célula eucariota, que comprende:

transfectar una célula eucariota con uno o más ácidos nucleicos que incluyen

(i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una meganucleasa, y (¡i) una segunda secuencia de ácido nucleico que incluye dicha secuencia exógena;

en el que dicha meganucleasa produce un sitio de escisión en dicho cromosoma y dicha secuencia exógena se inserta en dicho cromosoma en dicho sitio de escisión;

en el que dicha meganucleasa comprende un polipéptido que tiene al menos un 85 % de similitud de secuencia con los restos 6-160 de la meganucleasa 1-Msol de SEC ID N2: 6; y

en el que dicha meganucleasa tiene especificidad por un semisitio de secuencia de reconocimiento que difiere en al menos un par de bases de un semisitio dentro de una secuencia de reconocimiento de meganucleasa 1-Msol seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N2: 7 y SEC ID N2: 8; en el que:

(1) se ha alterado la especificidad en la posición -1:

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K75, Q77, A49, C49 y K79;

(b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en C77, L77 y Q79, o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K77, R77, E49 y E79; y/o

(2) se ha alterado la especificidad en la posición -2:

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en Q75, K81, C47, 147 y L47;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E75, D75, R47, K47, K81 y R81;o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K75, E47y E81;yo

(3) se ha alterado la especificidad en la posición -3:

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en Q72, C26, L26, V26, A26 y L26;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E72, Y72, H26, K26 y R26; o

(c) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K72, Y72 y H26; y/o

(4) se ha alterado la especificidad en la posición -4:

(a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K28, K83 y Q28;

(b) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R83 y K82, o

(c) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K28 y Q83; y/o

(5) se ha alterado la especificidad en la posición -5:

(a) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R45 y E28;

(b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación que comprende Q28; o

(c) a una C en una hebra sentido mediante una modificación que comprende R28; y/o

(6) se ha alterado la especificidad en la posición -6:

(a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K43, V85, L85 y Q30;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E43, E85, K30 y R30; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R43, K43, K85, R85, E30 y D30; y/o

(7) se ha alterado la especificidad en la posición -7:

(a) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E32 y E41;

(b) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R32, R41 y K41;

(c) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K32, M41, L41 e 141; y/o

(8) se ha alterado la especificidad en la posición -8:

(a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K32 y K35;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación que comprende E32; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación que consiste en K32, K35 y R35; y/o

(9) se ha alterado la especificidad en la posición -9;

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en N34 y H34;

(b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en S34, C34, V34, T34 y A34; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K34, R34 y H34,

en la que la meganucleasa recombinante no comprende los restos 6-160 de la meganucleasa l-Msol de SEC ID N2: 6 con solo el par de modificaciones L28 y R83; y

con la condición de que la célula no sea una célula germinal humana o una célula embrionaria humana.

2. Un método para producir una célula eucariota genéticamente modificada que incluye una secuencia exógena insertada en un cromosoma de dicha célula eucariota, que comprende:

introducir una proteína de meganucleasa en una célula eucariota; y

transfectar dicha célula eucariota con una secuencia de ácido nucleico que incluye dicha secuencia exógena; en el que dicha meganucleasa produce un sitio de escisión en dicho cromosoma y dicha secuencia exógena se inserta en dicho cromosoma en dicho sitio de escisión;

en el que dicha meganucleasa comprende un polipéptido que tiene al menos un 85 % de similitud de secuencia con los restos 6-160 de la meganucleasa l-Msol de SEC ID N2: 6; y

en el que dicha meganucleasa tiene especificidad por un semisitio de reconocimiento de secuencia que difiere en al menos un par de bases de un semisitio en una secuencia de reconocimiento de meganucleasa l-Msol seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N2: 7 y SEC ID N2: 8; en el que:

(1) se ha alterado la especificidad en la posición -1:

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K75, Q77, A49, C49 y K79;

(b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en C77, L77 y Q79; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K77, R77, E49 y E79; y/o

(2) se ha alterado la especificidad en la posición -2:

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en Q75, K81, C47, I47 y L47;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E75, D75, R47, K47, K81 y R81;o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K75, E47 y E81; y/o

(3) se ha alterado la especificidad en la posición -3:

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en Q72, C26, L26, V26, A26 e I26;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E72, Y72, H26, K26 y R26; o

(c) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K72, Y72 y H26; y/o

(4) se ha alterado la especificidad en la posición -4:

(a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K28, K83 y Q28;

(b) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R83 y K83; o

(c) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K28 y Q83; y/o

(5) se ha alterado la especificidad en la posición -5:

(a) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R45 y E28;

(b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación que comprende Q28; o

(c) a una C en una hebra sentido mediante una modificación que comprende R28; y/o

(6) se ha alterado la especificidad en la posición -6:

(a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K43, V85, L85 y Q30;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E43, E85, K30 y R30; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R43, K43, K85, R85, E30 y D30; y/o

(7) se ha alterado la especificidad en la posición -7:

(a) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E32 y E41;

(b) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R32, R41 y K41;

(c) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K32, M41, L41 e 141; y/o

(8) se ha alterado la especificidad en la posición -8:

(a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K32 y K35;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación que comprende E32; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación que consiste en K32, K35 y R35; y/o

(9) se ha alterado la especificidad en la posición -9:

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en N34 y H34;

(b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en S34, C34, V34, T34 y A34; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K34, R34 y H34,

en la que la meganucleasa no comprende los restos 6-160 de la meganucleasa l-Msol de SEC ID N2: 6 con solo el par de modificaciones L28 y R83; y

con la condición de que la célula no sea una célula germinal humana o una célula embrionaria humana.

3. Un método para producir una célula eucariota genéticamente modificada interrumpiendo una secuencia diana en un cromosoma de dicha célula eucariota, que comprende:

transfectar una célula eucariota con un ácido nucleico que codifica una meganucleasa;

en el que dicha meganucleasa produce un sitio de escisión en dicho cromosoma y dicha secuencia diana se interrumpe mediante unión terminal no homologa en dicho sitio de escisión;

en el que dicha meganucleasa comprende un polipéptido que tiene al menos un 85 % de similitud de secuencia con los restos 6-160 de la meganucleasa l-Msol de SEC ID N2: 6; y

en el que dicha meganucleasa tiene especificidad por un sem isitio de reconocimiento de secuencia que difiere en al menos un par de bases de un semisitio en una secuencia de reconocimiento de la meganucleasa de l-Msol seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N2: 7 y SEC ID N2: 8; en la que:

(1) se ha alterado la especificidad en la posición -1:

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K75, Q77, A49, C49 y K79;

(b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en C77, L77 y Q79; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K77, R77, E49 y E79; y/o

(2) se ha alterado la especificidad en la posición -2:

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en Q75, K81, C47, I47 y L47;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E75, D75, R47, K47, K81 y R81:o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K75, E47 y E81; y/o

(3) se ha alterado la especificidad en la posición -3:

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en Q72, C26, L26, V26, A26 e I26;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E72, Y72, H26, K26 y R26; o

(c) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K72, Y72 y H26; y/o

(4) se ha alterado la especificidad en la posición -4:

(a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K28, K83 y Q28;

(b) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R83 y K83; o

(c) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K28 y Q83; y/o

(5) se ha alterado la especificidad en la posición -5:

(a) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R45 y E28;

(b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación que comprende Q28; o

(c) a una C en una hebra sentido mediante una modificación que comprende R28; y/o

(6) se ha alterado la especificidad en la posición -6:

(a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K43, V85, L85 y Q30;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E43, E85, K30 y R30; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R43, K43, K85, R85, E30 y D30; y/o

(7) se ha alterado la especificidad en la posición -7:

(a) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E32 y E41;

(b) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R32, R41 y K41;

(c) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K32, M41, L41 e 141; y/o

(8) se ha alterado la especificidad en la posición -8:

(a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K32 y K35;

(b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación que comprende E32; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación que consiste en K32, K35 y R35; y/o

(9) se ha alterado la especificidad en la posición -9:

(a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en N34 y H34;

(b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en S34, C34, V34, T34 y A34; o

(c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K34, R34 y H34,

en el que la meganucleasa recombinante no comprende los restos 6-160 de la meganucleasa l-Msol de SEC ID Ne: 6 con solo el par de modificaciones L28 y R83; y

con la condición de que la célula no sea una célula germinal humana o una célula embrionaria humana.

4. Un método para producir un organismo no humano genéticamente modificado que comprende:

producir una célula eucariota no humana genéticamente modificada de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3; y crecer dicha célula eucariota no humana genéticamente modificada para producir dicho organismo genéticamente modificado.

5. Un método como en la reivindicación 4 en el que:

dicha célula eucariota no humana se selecciona del grupo que consiste en un zigoto, una célula de blastocisto, una célula madre embrionaria y una célula de protoplasto.

6. Un método como en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que:

dicha secuencia de ácido nucleico que incluye dicha secuencia exógena comprende además secuencias homologas a las secuencias flanqueando dicho sitio de escisión y dicha secuencia exógena se inserta en dicho sitio de escisión mediante recombinación no homologa; o dicho ácido nucleico carece de homología sustancial con dicho sitio de escisión y dicha secuencia exógena se inserta en dicho cromosoma mediante unión terminal no homologa.