Método de obtención de megacariocitos y plaquetas.

La presente invención se refiere al uso del gen SCL, de secuencia nucleotídica (GenBank NM_003189.

2, NP_003180.1) SEQ ID NO: 1, para obtener megacariocitos productores de plaquetas funcionales a partir de células madre, donde dichas células madre no han sido obtenidas por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima.

Método de obtención de megacariocitos y plaquetas.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología y la medicina, y más concretamente en el ámbito de las terapias avanzadas. Específicamente, se refiere al uso de las células madre para la obtención de megacariocitos productores de plaquetas funcionales, para su empleo frente a enfermedades derivadas de anomalías hematopoyéticas. También se refiere a los megacariocitos y plaquetas obtenidos por dicho método, y a los sistemas y/o dispositivos productores de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las plaquetas son fragmentos citoplasmáticos enucleados que son liberados desde megacariocitos maduros (MKs) . Los MKs se originan desde células madre hematopoyéticas (HSCs) por un proceso de diferenciación conocido por megacariopoyesis. Una vez formados, los MKs sufren un proceso de maduración (trombopoyesis) de donde resultan la producción y liberación de las plaquetas (Kaushansky, K. 2008. Blood 111 (3) :981-6) . El trasplante de plaquetas es necesario para el tratamiento de trombocitopenias de origen fisiológico, leucemias, enfermedades genéticas o inducidas por quimioterapia agresiva. Debido a que la vida media de las plaquetas es muy baja y al número limitado de plaquetas que se obtienen de los donantes en los bancos de sangre, la generación de sistemas ex vivo alterativos para la producción de plaquetas es una opción muy prometedora (Lambert, M.P. et al., 2013. Blood 121 (17) :3319–24.; Slichter, S.J. 2004. Transfusion Medicine Reviews 18 (3) :153–67.) . Uno de los retos en medicina es proporcionar a los hospitales una fuente constante de plaquetas, aunque hasta ahora ha sido imposible, ya que es totalmente dependiente de la disponibilidad y el altruismo de los donantes. Por lo tanto, la generación de un sistema donante-independiente capaz de proporcionar plaquetas para transfusión constantemente y eficientemente sería ideal para satisfacer las necesidades de las plaquetas para tratamiento de trombocitopenias en clínica (Lambert et al., M.P. 2013. Blood 121 (17) :3319–24.) .

Durante las dos últimas décadas, varios grupos han sido capaces de generar MKs y plaquetas in vitro a partir de HSC CD34+ obtenidas desde sangre periférica, cordón umbilical, hígado fetal y médula ósea, pero la capacidad de expansión limitada de las

células HSC CD34+ restringe su uso como una fuente de plaquetas eficiente y constante (Choi, E.S. et al. 1995. Blood 85 (2) :402–13; Tao, H.et al., 1999. Exp. Hematol. 27 (2) :293–301; Ma, D.C. et al. 2000. Eur. J. Haematol. 64 (5) :304–14; De Bruyn, C. et al. 2005. Stem Cells Dev. 14 (4) :415–24) . Por el contrario, las células madre embrionarias humanas (hESCs) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) se caracterizan por una capacidad de crecimiento ilimitado y la potencialidad de diferenciarse en cualquier linaje celular, convirtiéndose una alternativa muy prometedora para terapias en hematología (Thomson, J.A. et al. 1998. Science 282 (5391) :1145–7; Takahashi, K. et al. 2007. Cell 131 (5) :861–72; Krimbel, E.A. y Lu,

S.J. 2011. Stem Cells Int 2011:273076.) . En base a estas propiedades, varios laboratorios en todo el mundo han optimizado diferentes estrategias para la generación de megacariocitos y plaquetas funcionales a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) (Takayama, N. et al. 2008. Blood 111 (11) :5298–306; Takayama, N. et al. 2010. J. Exp. Med. 207 (13) :2817–30; Lu, S.J. et al., 2011. Cell Res. 21 (3) :530–45; Pick, M. et al., 2013. PLoS One 8 (2) :e55530) . Hasta la fecha, estos estudios han generado megacariocitos y plaquetas que puedan ser activados in vitro por estímulos clásicos (ADP, fibrinógeno o trombina) (Takayama, N. et al. 2008. Blood 111 (11) :5298–306; Lu, S.J. et al., 2011. Cell Res. 21 (3) :530–45) y plaquetas funcionales que participan en la formación de coágulos in vivo (Takayama, N. et al. 2010. J. Exp. Med. 207 (13) :2817–30; Lu, S.J. et al., 2011. Cell Res. 21 (3) :530–45) . Sin embargo, estas células poseen la limitación de producir un número reducido de megacariocitos por cada célula madre pluripotente de partida y de plaquetas en comparación con las producciones in vivo (Tijssen, M.R. y Ghevaert C.J., 2013. Thromb Haemost 11 (4) :593–604) . Por lo tanto, es necesario seguir trabajando en la optimización de protocolos más eficientes de megacariopoyesis y trombopoyesis desde hPSCs.

Estas mejoras podrían basarse en el conocimiento de los mecanismos moleculares que controlan la diferenciación megacariocítica. Un gran número de factores de transcripción se han asociado a la regulación de la megacariopoyesis y trombopoyesis (Goldíarb, A.N. 2007. Oncogene 26 (47) :6795–802) . Entre estos mecanismos, SCL/TAL1 ha centrado la atención no sólo en el establecimiento de la hematopoyesis en ratón (Shivdasani, R.A. et al., 1995. Nature 373 (6513) :432–434; Porcher, C. et al., 1996. Cell 86 (1) :47–57) , sino también en eritroides y megacariocitos (Mikkola, H.K. et al., 2003. Science 421 (6922) :547–51; Hall, M.A. et al., 2003. PNAS 100 (3) :992–7; Schlaeger et al., 2005. Blood 105 (10) :3871–4) .

Se ha demostrado que la sobreexpresión de SCL aumenta la diferenciación hematopoyética de hPSCs y potencia las características de los eritroides (Yung, S. et al., 2011. Hum. Mol. Gen. 20 (24) :4932–46; Real, P.J. et al., 2012. Mol. Therapy 20 (7) :1443–53) . SCL participa en el cometido de los megacariocitos, se propone que la sobreexpresión de este factor de transcripción hematopoyético aumentará la eficiencia de la megacariopoyesis y trombopoyesis de hPSCs. Esta sobreexpresión a priori no supondría ningún riesgo cuando las plaquetas son transfundidas, ya que las plaquetas son enucleadas y no llevan más copias de genes sobreexpresados ni de la proteína traducida. Esto representa un paso adelante en el camino de generación de plaquetas a gran escala para su uso en trasplantes humanos.

Por tanto, las hPSCs son una herramienta ideal para optimizar los protocolos de megacariopoyesis y trombopoyesis humana destinada a la ilimitada producción de plaquetas para su uso en clínica. Estos protocolos optimizados representarán una plataforma para el estudio de los procesos moleculares y celulares implicados en la megacariopoyesis y trombopoyesis humana, y podría ser utilizado para modelar enfermedades humanas que afectan a estos procesos de diferenciación, tales como las leucemias megacarioblásticas agudas (AMKL) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Un primer aspecto de la invención se refiere al uso del gen SCL/TAL1, de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1, de ahora en adelante secuencia nucleotídica de la invención, para obtener megacariocitos productores de plaquetas funcionales a partir de células madre.

Un segundo aspecto de la invención se refiere al uso de una construcción genética de ADN o ARN, de ahora en adelante construcción genética de la invención, que comprende uno de los siguientes tipos de secuencias:

a. secuencia de nucleótidos, que comprende, al menos, la secuencia nucleotídica de la invención, para su transcripción in vitro o in vivo, o

b. secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende secuencia nucleotídica de la invención, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar,

para obtener megacariocitos productores de plaquetas funcionales a partir de células madre. Preferiblemente, la construcción genética es un vector, de ahora en adelante vector de la invención, y aún más preferiblemente es un vector lentiviral. En otra realización preferida, las células madre se seleccionan de la lista que consiste en células madre hematopoyéticas, células madre pluripotentes, células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, fibroblastos, megacariocitos inducidos (Ono, Y. et al., 2012 Blood 120 (18) :3812-21) o cualquiera de sus combinaciones. Aún más preferiblemente, son células madre pluripotentes (PSCs) , más preferiblemente son células madre de mamífero, y aún mucho más preferiblemente, son células humanas.

Un tercer aspecto de la invención se refiere un megacariocito productor de plaquetas funcionales, de ahora en adelante megacariocito de la invención, obtenido por un método, de ahora en adelante método de producción de plaquetas de la invención, que comprende:

a) poner en contacto la construcción... [Seguir leyendo]

1. . Uso de una secuencia polinucleotídica que consiste en la SEQ ID No 1 o en una secuencia nucleotídica con una identidad de al menos un 80% con la secuencia SEQ ID NO: 1, para obtener megacariocitos productores de plaquetas funcionales a partir de células madre pluripotentes, donde dichas células madre no han sido obtenidas por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima.

2. Uso de un vector que comprende la secuencia nucleotídica definida de acuerdo con la reivindicación anterior, para obtener megacariocitos productores de plaquetas funcionales a partir de células madre pluripotentes, donde dichas células madre no han sido obtenidas por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima 3. El uso del vector de acuerdo con la reivindicación anterior, donde el vector es un vector lentiviral.

4. Uso de una construcción genética que comprende el vector tal y como éste se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 2-3, para obtener megacariocitos productores de plaquetas funcionales a partir de células madre pluripotentes, donde dichas células madre no han sido obtenidas por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima 5. El uso del vector según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, o de la construcción genética según la reivindicación 4, donde las células madre pluripotentes se seleccionan de la lista que consiste en células madre hematopoyéticas, células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, fibroblastos, megacariocitos inducidos o cualquiera de sus combinaciones con la premisa de que dichas células madre no hayan sido obtenidas por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima 6. El uso del vector o de la construcción genética según la reivindicación 5, donde las células madre son células madre pluripotentes inducidas.

7. El uso del vector o de la construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 5-6, donde las células madre son células de un mamífero.

8. El uso del vector o de la construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde las células madre son células madre humanas no embrionarias.

9. Un megacariocito productor de plaquetas funcionales obtenido por un método que comprende:

a) poner en contacto un vector tal y como se ha definido éste en cualquiera de las reivindicaciones 2-3, o una construcción genética según se define en la reivindicación 4, con una célula madre, donde dicha célula madre no ha sido obtenida por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima;

b) seleccionar las células madre del paso (a) que han sido transducidas o transformadas con el vector y/o la construcción genética; y

c) diferenciar las células madre del paso (b) a megacariocitos maduros.

10. El megacariocito según la reivindicación anterior, donde las células madre son células madre pluripotentes inducidas.

11. El megacariocito según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, donde las células madre son células de un mamífero.

12. El megacariocito según cualquiera de las reivindicaciones 9-11, donde las células madre son células madre humanas no embrionarias.

13. El megacariocito según cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde la diferenciación de las células madre a megacariocitos del paso (c) se lleva a cabo diferenciando las células madre a progenitores megacariocíticos mediante la adición de una composición que comprende un inhibidor de histona deacetilasa.

14. El megacariocito según la reivindicación 13, donde el inhibidor de histona deacetilasa es la Tricostatina A.

15. El megacariocito según cualquiera de las reivindicaciones 9-14, donde la diferenciación de las células madre a megacariocitos maduros del paso (c) comprende co-cultivar las células madre con células del estroma.

16. Un método para la producción de plaquetas in vitro que comprende cultivar el megacariocito productor de plaquetas funcionales, tal y como se ha definido éste en cualquiera de las reivindicaciones 9-15, en un medio de cultivo adecuado.

17. El uso de un megacariocito obtenido según cualquiera de las reivindicaciones 9-15, o de una plaqueta obtenida según el método de la reivindicación 16, en la elaboración de un medicamento o como vector dirigido a los sitios de daño vascular.

18. El uso de un megacariocito obtenido según cualquiera de las reivindicaciones 9-15, o de una plaqueta obtenida según el método de la reivindicación 16, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de patologías relacionas con las plaquetas y/o leucemias megacarioblásticas agudas.

19. Uso de un inhibidor de histona deacetilasa para diferenciar una célula madre a megacariocito, donde dicha célula madre no ha sido obtenida por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima.

20. Uso de una composición que comprende un inhibidor de histona deacetilasa para diferenciar una célula madre a megacariocito, donde dicha célula madre no ha sido obtenida por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima.

21. Un sistema o dispositivo de producción de plaquetas para la producción in vitro y/o ex vivo de las plaquetas de la invención que comprende:

a) un biorreactor para la expansión de las células madre pluripotentes, donde dichas células madre no han sido obtenidas por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima, en presencia de un primer medio de crecimiento en comunicación fluída con b) una cámara de maduración que comprende células estromales y/o un nicho de médula ósea artificial y un segundo medio de crecimiento, en el que la cámara de maduración está en comunicación fluída con c) una cámara de separación de células para la selección de megacariocitos maduros que está en comunicación fluída con d) un módulo de producción de plaquetas que comprende una pluralidad de cámaras de producción de plaquetas, una matriz tridimensional, un tercer medio de crecimiento, y una pluralidad de bombas para mover el tercio del medio de crecimiento a través de las cámaras de producción de plaquetas, en el que el módulo de producción de plaquetas está en comunicación fluída con e) una cámara de recogida de plaquetas; donde las células madre del paso (a) están transfectadas con la secuencia polinucleotídica tal y como se ha definido ésta en la reivindicación 1.

Fig.1

Fig.1

Fig.1

Fig.1

Fig.2

Fig. 2

Fig. 2

Fig. 3

Fig. 3

Fig. 3

Fig. 4

Fig. 4

secuencias GENYO-13008_ST25 SEQUENCE LISTING

<110> Fundación Pública Andaluza Progreso y Salud

<120> Método de obtención de megacariocitos y plaquetas

<130> GENYO-13008

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5018

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1 gcccgggact atcccttcgc ggtgtagcgg cagccggaga cctggctgag gaggcaaccg 60 cgtagacacc tccctgctta gaaaacaaac actgaaccag accgatccca gttggagggt 120 tcgaaaatgt tccagacagc ctgtcgggag gggttgttgt tgctgttgga ctaaatagct 180 attcctgatt ggtcatgtat agggtttttt aaggcgggtg gggggaggag ggggtagagg 240 aaaggctcca aacacctgca ggttgggggc ggaaagctgt ttgcgattcc ctggactggt 300 tggtcgggga caggaggtaa ttcccagcca ttgaccccca tttctctctc tccctccctc 360 ttgccctgcc tctttctctc cacccctatc tttcctggaa actcgctttg ggcgcggcag 420 atcgcccagg accacaccgc agcgtaactg caggcctctc agcgaaaaag ggggaaagca 480 aagacccggg tgtgcatcct cttcctcggc ttccgcccct ttccggcgga gtggagatcc 540 tattcagagg ggccggtctc tctaaatatg ccccaggatg accgagcggc cgccgagcga 600 ggcggctcgc agtgaccccc agctagaggg acgggacgcg gccgaggcca gcatggcccc 660 cccgcacctg gtcctgctga acggcgtcgc caaggagacg agccgcgcgg ccgcagcgga 720 gcccccagtc atcgaactgg gcgcgcgcgg aggcccgggg ggcggccctg ccggtggggg 780 cggcgccgcg agagacttaa agggccgcga cgcggcgacg gccgaagcgc gccatcgggt 840 gcccaccacc gagctgtgca gacctcccgg gcccgccccg gcccccgcgc ccgcctcggt 900 tacagcggag ctgcccggcg acggccgcat ggtgcagctg agtcctcccg cgctggctgc 960 ccccgccgcc cccggccgcg cgctgctcta cagcctcagc cagccgctgg cctctctcgg 1020 cagcgggttc tttggggagc cggatgcctt ccctatgttc accaccaaca atcgagtgaa 1080 gaggagacct tccccctatg agatggagat tactgatggt ccccacacca aagttgtgcg 1140 gcgtatcttc accaacagcc gggagcgatg gcggcagcag aatgtgaacg gggcctttgc 1200 cgagctccgc aagctgatcc ccacacatcc cccggacaag aagctcagca agaatgagat 1260 cctccgcctg gccatgaagt atatcaactt cttggccaag ctgctcaatg accaggagga 1320 ggagggcacc cagcgggcca agactggcaa ggaccctgtg gtgggggctg gtgggggtgg 1380 aggtggggga gggggcggcg cgcccccaga tgacctcctg caagacgtgc tttcccccaa 1440 ctccagctgc ggcagctccc tggatggggc agccagcccg gacagctaca cggaggagcc 1500 cgcgcccaaa cacacggccc gcagcctcca tcctgccatg ctgcctgccg ccgatggagc 1560 Page 1

secuencias GENYO-13008_ST25

cggccctcgg tgatgggtct gggccaccag gatcagccag gagggcgttc ttaggctgct 1620 gggatggtgg gcttcagggc aggtggggtg agaattgggc ggctctgaag caaggcggtg 1680 gacttgaact ttcctggatg tctgaacttt gggaagcctt tactgaccct ggggctggct 1740 tttctgtttc ctgtaccagt aggagatcag aaaaatggag caaagtggta ggtacttttt 1800 gtgaagacgg cacggtcttc cctcttccct cagtcccaaa tccttcccaa gtaagaggct 1860 ggagttgtca ctgcttttgg cctggagttt gggatccctg tctttcctaa gacctggggt 1920 tgtcagctct catctgaggc atccagcagt ctctgccttg cctttagccc ctcccaagct 1980 ggctggggtg gcctgtgtgg ccacttctgt ccatatttat aggtacccaa tagctgccca 2040 tttcgtgagc cccatcttca cccaggccta tgttgatcca tccagcttgc cagatgctgc 2100 agagtcacaa gcctcgaggt gccttcttca gggcctggtt gaagaagatg atcagtggac 2160 agtctgctct agatgagctg ggccggaggg tcaggaaacc cagtcgccct tacttcttgc 2220 cctggggatc aaagttctgc tttctcccca atgagacttg ccttcctaag cctgtggctg 2280 tggagacaat gtctgcagcc ctgagaaagc cctgtcgggc tttgtgtgaa ggcagagaaa 2340 gggacaatga tagtagagtg atatggagca agagatattt tgggcatgtg ggcttcaact 2400 cctcgacatc actgttcatg ctggcgagtg aatgccagtg tgctgatggg cgtacgctgg 2460 tgctgagtag atgcgcagcc ccatctgtgc attctcctgg atgcttagag ggatttcttt 2520 gctgtaagat gtctgtttgc tgatggtctg gtctatgttc cgaattgagc acaaaacctg 2580 tcctatgaat gctttgcatt tggaattttt gcttgacttc agttattggt ggaatcttta 2640 gcgctcaata ggaccaggat ccagcctcac ttctagggta tgggaaatcc aatcagagac 2700 caggccctgg ctaagaccca aacatatgca cattcactta gcagaacctt aaacacccct 2760 cagttgtgca gcttttggtc atcaagggtg cgtctgggag gttggtttaa tgcaatagaa 2820 gtgctcccct ctgaaagttg tacatgaaat ttttgtaaat cacatcctta tccttcatct 2880 tttaaagaaa taaccactgc aagtcctttt gtaaagtgaa gaatcctttt gtagaatgaa 2940 ccactgcccc ttcattgatt tcctgtgtca atccagatgg tgggatgtgg ttttcttaag 3000 gtgaggcctg tctgtgacct gcatctaagc ccatgggaca aattgcacag aagtcctgta 3060 tgtctgtcat tgtaccctta agtcacccta gccctctccc tctaggctct gccttcgagg 3120 tcagaggaga gatagcctgt ggccctgtcc tgccatgcaa gaactcatca ctgtggctgt 3180 ctggaaagcc cccccttata gtttgggctt cagcctagtg gcttgtcctc accatgatgg 3240 ggccctaatt cagccatgta cagacagaga atatgtctgc tcctttcccc ttccttttaa 3300 gtaaggtcca attctcgagc ttggggcaac attgttcacc tttgtagcac tcaggctctc 3360 cattcaattt caggctcccc agatcatgtt ttggtgaaaa ttagggttgg ttcctttcca 3420 acgtttggaa gatcctgtga ggagccccat ctgtctaaag atagagtcat tgctgtagga 3480 tctaaggctg tttgcttcac cgtggattcg cttgagttag gaatgagaag tagccacagt 3540 atggatgggt ggatgggttt tatgagatgg atcacatatt ttattaagaa ctcaaacttc 3600

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secuencias GENYO-13008_ST25 tggctccctc ttctttcaga cttgccatgt gactctggct tggcctatct cctagggcta 3660 tggtgtggac tgaatgggat catgaaagta gacagttttg agaacgtaaa gaactttttc 3720 ttttccctca atctcaatcc tgcagtgggg tttcgcagcc tgagtccacg acctaggcag 3780 taggccggtg tgcctgactg cccagcattt gggtaattta gattgtaaac cgctttggcc 3840 tgagttattg agattgtcct catttctcca gattatctat ttgtgtgtgt gtgtgtgtgt 3900 gtgtgagaga cggtgtcttg ttctgtcact caggctggag tacagtggtg ccatcattgc 3960 tgtctgcagc cttgaactct gggctcaagc aatcctctca cctcagcctc ccgagtaggg 4020 aggaccacag gtgtgagcca ccacacctgg ctaattttta cttttttttt tttttggtag 4080 agatggagtc ttgctatatt gcccaggctg gtcttgaagt cctggcttca ggcaattctc 4140 ctgcctttgc ctccagaagc actgggatca caggtgtcag ccattgcacc cagcccagat 4200 tgtcttaatt tctatcttgt tccaaggcca gggacagtaa taagaatgga aaagagatat 4260 gggaacactg gcagactgtg taaaatgtaa tgcaactacc caaaacaagc ctggtaggaa 4320 agggcaagtc tttaggtctt tgtaagaact aaagaagatc tgtaattttt attttcaccc 4380 tctgtacccc atgaccttat ccttcctctc cttccttgtt acccatgaaa aactggcaac 4440 attccaagaa tagcatctgt acaaagggga aagaacataa aggtaaaaca aaacaaaaca 4500 acattttgag aacaaagatg accataacca ctgaagggaa tcacatcttt taagacaaat 4560 tcatattctt ttatttgtta tggcagatga caagatggta caacctttat tcttttccaa 4620 aataaaacaa agggcacagc atctgtagtc agccgacaac tatttcggcc ttttgggggt 4680 gggtctggcc gtacttgtga tttcgatggt acgtgaccct ctgctgaaga cttgccccct 4740 gcccgtgtac atagtgcatt gtttctgtgg gcgggcccag cactttccgt caacgttgta 4800 ctgtatgtga tgaattgcgt tggtctctgc atttttctgc agaagaggag taaccgctcc 4860 aggtaccttg acctttgtac agcccagagg ccaacactgt gggtgtgtga ctctttagca 4920 aaaaaaaccc atgtggtgat gatgtgtata tatatgtgag gatgtatcgg gaagatttct 4980 aaataaaagt tttacaaagg ggaaaaaaaa aaaaaaaa 5018

<210> 2

<211> 331

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Thr Glu Arg Pro Pro Ser Glu Ala Ala Arg Ser Asp Pro Gln Leu 1 5 10 15

Glu Gly Arg Asp Ala Ala Glu Ala Ser Met Ala Pro Pro His Leu Val 20 25 30

Leu Leu Asn Gly Val Ala Lys Glu Thr Ser Arg Ala Ala Ala Ala Glu 35 40 45

Pro Pro Val Ile Glu Leu Gly Ala Arg Gly Gly Pro Gly Gly Gly Pro Page 3

secuencias GENYO-13008_ST25 50 55 60

Ala Gly Gly Gly Gly Ala Ala Arg Asp Leu Lys Gly Arg Asp Ala Ala 65 70 75 80

Thr Ala Glu Ala Arg His Arg Val Pro Thr Thr Glu Leu Cys Arg Pro 85 90 95

Pro Gly Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser Val Thr Ala Glu Leu 100 105 110

Pro Gly Asp Gly Arg Met Val Gln Leu Ser Pro Pro Ala Leu Ala Ala 115 120 125

Pro Ala Ala Pro Gly Arg Ala Leu Leu Tyr Ser Leu Ser Gln Pro Leu 130 135 140

Ala Ser Leu Gly Ser Gly Phe Phe Gly Glu Pro Asp Ala Phe Pro Met 145 150 155 160

Phe Thr Thr Asn Asn Arg Val Lys Arg Arg Pro Ser Pro Tyr Glu Met 165 170 175

Glu Ile Thr Asp Gly Pro His Thr Lys Val Val Arg Arg Ile Phe Thr 180 185 190

Asn Ser Arg Glu Arg Trp Arg Gln Gln Asn Val Asn Gly Ala Phe Ala 195 200 205

Glu Leu Arg Lys Leu Ile Pro Thr His Pro Pro Asp Lys Lys Leu Ser 210 215 220

Lys Asn Glu Ile Leu Arg Leu Ala Met Lys Tyr Ile Asn Phe Leu Ala 225 230 235 240

Lys Leu Leu Asn Asp Gln Glu Glu Glu Gly Thr Gln Arg Ala Lys Thr 245 250 255

Gly Lys Asp Pro Val Val Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 260 265 270

Gly Gly Ala Pro Pro Asp Asp Leu Leu Gln Asp Val Leu Ser Pro Asn 275 280 285

Ser Ser Cys Gly Ser Ser Leu Asp Gly Ala Ala Ser Pro Asp Ser Tyr 290 295 300

Thr Glu Glu Pro Ala Pro Lys His Thr Ala Arg Ser Leu His Pro Ala 305 310 315 320

Met Leu Pro Ala Ala Asp Gly Ala Gly Pro Arg 325 330 Page 4

secuencias GENYO-13008_ST25

<210> <211> <212> <213> 3 18 DNA Artificial Sequence

<220> <223> primer GAPDH Fw

<400> 3 gaaggtgaag gtcggagt 18

<210> <211> <212> <213> 4 20 DNA Artificial Sequence

<220> <223> primer GAPDH Rv

<400> 4 gaagatggtg atgggatttc 20

<210> <211> <212> <213> 5 21 DNA Artificial Sequence

<220> <223> primer CD41 Fw

<400> 5 tgagccgcat ttacgtggaa a 21

<210> <211> <212> <213> 6 21 DNA Artificial Sequence

<220> <223> primer CD41 Rv

<400> 6 cttcacagta acgcttgtcc c 21

<210> <211> <212> <213> 7 21 DNA Artificial Sequence

<220> <223> primer CD61 Fw

<400> 7 gtgacctgaa ggagaatctg c 21

<210> <211> <212> <213> 8 21 DNA Artificial Sequence

<220> <223> primer CD61 Rv Page 5

secuencias GENYO-13008_ST25

<400> 8 tcactcactg ggaactcgat g 21

<210> <211> <212> <213> 9 21 DNA Artificial Sequence

<220> <223> primer FLI-1 Fw

<400> 9 ccaacgagag gagagtcatc g 21

<210> <211> <212> <213> 10 21 DNA Artificial Sequence

<220> <223> primer FLI-1 Rv

<400> 10 ttccgtgttg tagagggtgg t 21

<210> <211> <212> <213> 11 20 DNA Artificial Sequence

<220> <223> primer GATA1 Fw

<400> 11 tcactccctg tccccaatag 20

<210> <211> <212> <213> 12 20 DNA Artificial Sequence

<220> <223> primer GATA1 Rv

<400> 12 ggagagttcc acgaagcttg 20

<210> <211> <212> <213> 13 21 DNA Artificial Sequence

<220> <223> primer NEF2 Fw

<400> 13 gcaggaacag ggtgatacag c 21

<210> <211> <212> <213> 14 20 DNA Artificial Sequence Page 6

secuencias GENYO-13008_ST25

<220>

<223> primer NEF2 Rv

<400> 14 gagcaggggc agtaagttgt

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer SCL Fw

<400> 15 ggatgccttc cctatgttca 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer SCL Rv

<400> 16 ggtgtgggga ccatcagtaa 20

Page 7