Medio exento de proteínas animales para el cultivo de células.

Un procedimiento para producir un virus que comprende:

hacer crecer un cultivo de células en un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de soja a una concentración de entre el 0,

05 % (p/v) al 1 % (p/v) e hidrolizado de levadura a una concentración de entre el 0,05 % (p/v) al 0,3 % (p/v);

infectar las células con un virus; e

incubar las células infectadas para propagar el virus.

Medio exento de proteínas animales para el cultivo de células .

CAMPO DE LA INVENCIÓN

En este documento se describe un medio de cultivo celular exento de proteínas animales que comprende unacombinación de un hidrolizado de soja y un hidrolizado de levadura. La invención se refiere a procesos de cultivoexentos de proteínas animales, en los que las células pueden ser cultivadas, propagadas y pasadas sin proteínasanimales. Estos procesos son útiles para cultivar células, tales como células infectadas con un virus, y para producirproductos biológicos mediante procesos de cultivo celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Para el cultivo de células, particularmente de células eucariotas, y más específicamente de células de mamífero, existe una necesidad constante de usar medios de cultivo especiales que hagan disponibles las sustanciasnutrientes y las sustancias nutrientes de crecimiento que son necesarias para un crecimiento eficaz de las células y parala producción de las proteínas o de los virus que se desean. Las formulaciones de medios de cultivos celulares se hancomplementado con diversos aditivos, que incluyen componentes indefinidos tales como suero bovino fetal (fetal calf serum, FCS) , diversas proteínas derivadas de animales y/o hidrolizados de proteínas de origen bovino.

En general, el suero o las sustancias derivadas del suero, tales como la albúmina, la transferrina o la insulina, pueden contener agentes no deseados que pueden contaminar los cultivos y los productos biológicos obtenidos a partirde los mismos. Adicionalmente, los aditivos derivados de suero humano deben ser ensayados para comprobar todos losvirus conocidos, incluyendo hepatitis y VIH, que pueden ser transmitidos por el suero. Además, el suero bovino y losproductos derivados del mismo, por ejemplo, la tripsina, son portadores de un riesgo de contaminación por BSE.Además, todos los productos derivados de suero pueden estar contaminados por agentes desconocidos. En el caso delsuero o de aditivos proteicos que derivan de seres humanos o de otras fuentes animales en cultivos celulares, existen numerosos problemas (por ejemplo, la calidad y la composición variables de los diferentes lotes y el riesgo decontaminación por agentes de micoplasma, virus o BSE) , particularmente si las células se usan para la producción deagentes medicinales o de vacunas para su administración a seres humanos.

Por lo tanto, se han realizado muchos intentos para proporcionar sistemas hospedadores y condiciones decultivo eficaces que no requieran suero ni otros compuestos proteicos animales. El medio simple exento de suero incluye típicamente medio basal, vitaminas, aminoácidos o sales orgánicas e inorgánicas, y quizás componentesadicionales para hacer el medio nutricionalmente complejo. Sin embargo, tales medios son a menudo insuficientesnutricionalmente y deben complementarse con complementos proteicos derivados de animales o versiones recombinantes de proteínas usadas en los cultivos celulares, tales como insulina, factor de crecimiento insulinoide uotros factores de crecimiento.

Para evitar el uso de complementos proteicos derivados de animales en medios de cultivo celulares exentos desuero, se han realizado muchos intentos para proporcionar medios de cultivo celulares que estén completamenteexentos de proteínas.

Cinatl y col., Cell Biology International 17: 885 – 895 (1993) describen el desarrollo de un medio (PFK-1) específico para la propagación continua de células VERO en una superficie de cultivo de polivinilo formal (PVF) .

En el documento WO 96/15231 se describe un medio exento de suero formado por un medio sintético mínimoesencial y extracto de levadura para la propagación de células de vertebrados y procesos de producción de virus.

En el documento WO 98/15614 se describe una formulación de medio compuesta por medio de un cultivocelular basal que comprende un péptido de arroz y un extracto de levadura o un digerido enzimático de los mismos, y/oun lípido vegetal para el crecimiento de células animales.

En el documento WO 01/23527 se describe un medio que comprende un hidrolizado de soja purificado para elcultivo de células recombinantes.

En el documento WO 00/03000 se describe un medio que comprende un hidrolizado de soja y un extracto delevadura, pero también requiere la presencia de formas recombinantes de proteínas animales, tales como factores decrecimiento.

Para una producción eficaz de los productos biológicos, tales como virus o proteínas recombinantes, esimportante que se alcance una densidad celular óptima para obtener el máximo rendimiento del producto.

Por lo tanto, existe una necesidad actual de aumentar el crecimiento, la actividad metabólica y la densidad delas células, y de proporcionar un medio de cultivo celular óptimo desprovisto de proteínas animales para la producciónde productos biológicos, tales como aquellos usados como medicinas o vacunas en seres humanos. Además, el procesamiento anterógrado, por ejemplo, la purificación del producto deseado a partir del medio de cultivo puede sermás eficaz en coste y tiempo si no hay proteínas animales presentes en el suero. Adicionalmente, las proteínasanimales inmunógenas indeseadas pueden inducir reacciones inmunológicas perjudiciales, que se evitan con la prácticade la presente invención.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se establece en las reivindicaciones.

Un objeto de la presente descripción es proporcionar un medio de cultivo celular exento de proteínas animales.Para conseguir este y otros objetos, se proporciona un medio de cultivo celular exento de proteínas animales quecomprende hidrolizado de soja e hidrolizado de levadura. El hidrolizado de soja puede estar presente en una concentración de al menos el 0, 05 % (p/v) y el hidrolizado de levadura está presente en una concentración de al menos

0, 05 % (p/v) . Opcionalmente, el hidrolizado de soja puede estar presente en una concentración de menos del 1, 0 % (p/v) y el hidrolizado de soja puede estar presente en una concentración de menos del 0, 3 % (p/v) . Opcionalmente, elhidrolizado de soja puede estar presente en una concentración de entre aproximadamente el 0, 2 % (p/v) aaproximadamente el 0, 6 % (p/v) y el hidrolizado de levadura puede estar presente en una concentración de entreaproximadamente el 0, 05 % (p/v) a aproximadamente el 0, 2 % (p/v) . Opcionalmente, el hidrolizado de soja puede estarpresente en una concentración de entre aproximadamente el 0, 25 % (p/v) a aproximadamente el 0, 35 % (p/v) y elhidrolizado de levadura puede estar presente en una concentración de entre aproximadamente el 0, 05 % a aproximadamente el 0, 15 % (p/v) . Opcionalmente, el hidrolizado de soja puede estar presente en una concentración deaproximadamente el 0, 3 % (p/v) y el hidrolizado de levadura puede estar presente en una concentración de aproximadamente el 0, 1 % (p/v) . Opcionalmente, el medio comprende 3 partes en peso de hidrolizado de soja por 1

parte en peso de hidrolizado de levadura. El hidrolizado de levadura puede ser un hidrolizado de levadura ultrafiltrado purificado, en el que al menos el 40 % de dicho hidrolizado de levadura tiene un peso molecular menor o igual a 500 Dalton. De forma similar, el hidrolizado de soja puede ser un hidrolizado de soja ultrafiltrado purificado, en el que almenos el 40 % de dicho hidrolizado de soja tiene un peso molecular menor o igual a 500 Dalton.

La invención también proporciona procedimientos para cultivar cultivos de células que comprendenproporcionar un medio que comprende hidrolizado de soja a una concentración de aproximadamente 0, 05 % (p/v) aaproximadamente el 1 % (p/v) e hidrolizado de levadura a una concentración de aproximadamente el 0, 05 % (p/v) a aproximadamente el 0, 3 % (p/v) ; y propagar las células en el medio para formar el cultivo celular. También puedenemplearse otras concentraciones de hidrolizados, como se ejemplificó anteriormente. Las células pueden ser célulasanimales, tales como células de insecto, células de ave, células de mamífero, células madre, y preferiblemente aquellas

células que se usan para la producción de virus in vitro. Las células también pueden ser células recombinantes. Algunos ejemplos de células incluyen aquellas elegidas del grupo de células formado por células BSC-1, células LLC-MK, célulasCV-1, células COS, células VERO, células MDBK, células MDCK, células CRFK, células RAF, células RK, células TCMK-1, células LLC-PK, células PK15, células LLC-RK, células MDOK, células BHK-21, células CHO, células NS-1, células MRC-5, células WI-38, células BHK, células 293 y células RK.

En este documento se describe también un proceso... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir un virus que comprende:

hacer crecer un cultivo de células en un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de sojaa una concentración de entre el 0, 05 % (p/v) al 1 % (p/v) e hidrolizado de levadura a una concentración de entre el 0, 05% (p/v) al 0, 3 % (p/v) ;

infectar las células con un virus; e incubar las células infectadas para propagar el virus.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichas células son células animales elegidas del grupo decélulas de insecto, células de ave y células de mamífero.

3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que dichas células de mamífero se seleccionan del grupo decélulas BSC-1, células LLC-MK, células CV-1, células VERO, células MDBK, células MDCK, células CRFK, células RAF, células TCMK-1, células LLC-PK, células PK15, células LLC-RK, células MDOK, células RK, células BHK-21, células WI-38, células 293 y células MRC-5.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho virus se selecciona del grupo del virus de la gripe, virus de vaccinia y de la viruela, virus de la viruela aviar, virus de la viruela vacuna, virus de la encefalitis transmitida porgarrapatas (tick-borne encephalitis, TBE) , virus de la polio, virus de la hepatitis A, virus de Ross River, virus de la fiebreamarilla y un virus quimérico derivado del mismo, virus del Nilo occidental, virus de la encefalitis japonesa, virus de larubéola, virus de la hepatitis C (HCV) , virus de la parotiditis, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial (respirator y syncytial virus, RSV) , virus del herpes simple (herpes simplex virus, HSV) , citomegalovirus (CMV) , virus de Epstein-Barr (EBV) , rotavirus y virus de la glosopeda (foot and mouth disease virus, FMDV) .

5. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichas células son células VERO y dicho virus seselecciona del grupo del virus de la gripe, virus de la TBE, virus de vaccinia, virus de la polio, virus de la hepatitis A, virus de Ross River, virus de la fiebre amarilla y un virus quimérico derivado del mismo, virus del Nilo occidental, virusde la encefalitis japonesa, virus de la rubéola, HCV, virus de la parotiditis, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial, HSV, CMV, EBV y rotavirus.

6. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho hidrolizado de soja y dicho hidrolizado de levaduraestán purificados.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho hidrolizado de soja y dicho hidrolizado de levaduraestán ultrafiltrados.

8. Un procedimiento para producir una composición inmunógena que comprende un virus o un antígeno del virus, en el que el procedimiento comprende:

hacer crecer un cultivo de células en un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de sojaa una concentración del 0, 05 % (p/v) al 1 % (p/v) e hidrolizado de levadura a una concentración del 0, 05 % (p/v) al 0, 3 % (p/v) ;

infectar las células con el virus;

incubar las células infectadas para propagar el virus;

recoger el virus o el antígeno del virus producido preparar una composición inmunógena a partir del virus o del antígeno del virus recogido.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho virus o antígeno del virus recogido se somete a unapurificación.

10. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que el procedimiento comprende:

hacer crecer un cultivo de células de mamífero, en el que las células se seleccionan del grupo de célulasrenales de mono, células renales de bovino, células renales de perro, células renales de cerdo, células renales de ratón, células renales de rata, células renales de oveja, células renales de hámster y células humanas en un medio de cultivoexento de proteínas animales que comprende hidrolizado de soja a una concentración del 0, 05 % (p/v) al 1 % (p/v) ehidrolizado de levadura a una concentración del 0, 05 % (p/v) al 0, 3 % (p/v) ;

infectar las células con un virus elegido del grupo de ortomixovirus, paramixovirus, reovirus, picornavirus, flavivirus, arenavirus, virus herpes, poxvirus, coronavirus y adenovirus;

incubar el cultivo de células para propagar el virus;

recoger el virus o el antígeno del virus así producido; y

preparar una composición inmunógena a partir del virus o del antígeno del virus recogido.

11. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho hidrolizado de soja y dicho hidrolizado de levaduraestán purificados.

12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho hidrolizado de soja y dicho hidrolizado de levaduraestán ultrafiltrados.

13. El procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en el que el virus se selecciona del grupo del virus de la gripe, virus de vaccinia y de la viruela, virus de la viruela aviar, virus de la viruela vacuna, virus de la encefalitis transmitida porgarrapatas (tick-borne encephalitis, TBE) , virus de la polio, virus de la hepatitis A, virus de Ross River, virus de la fiebreamarilla y un virus quimérico derivado del mismo, virus del Nilo occidental, virus de la encefalitis japonesa, virus de larubéola, virus de la hepatitis C (HCV) , virus de la parotiditis, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial (respirator y

syncytial virus, RSV) , virus del herpes simple (herpes simplex virus, HSV) , citomegalovirus (CMV) , virus de Epstein-Barr (EBV) , rotavirus y virus de la glosopeda (foot and mouth disease virus, FMDV) .

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8, 9 ó 13, en el que las células son células VERO y el virus es el virus de la gripe.