Medio de cultivo celular sin oligopéptidos.

Un procedimiento de expresión de al menos una proteína, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un cultivo de células;

(b) introducir al menos una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica al menos una proteína seleccionada del grupo de factor VII de coagulación, factor VIII de coagulación, factor IX de coagulación, vWF, ADAMTS 13 y furina en las células;

(c) seleccionar las células que llevan la secuencia de ácidos nucleicos; y

(d) expresar la proteína en las células en un medio sin oligopéptidos que comprende al menos 0,5 mg/l de una poliamina.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12160789.

Solicitante: BAXTER INTERNATIONAL INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: ONE BAXTER PARKWAY DEERFIELD, IL 60015 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: REITER, MANFRED, MUNDT, WOLFGANG, GRILLBERGER, LEOPOLD, MITTERER, ARTUR.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N5/00 (Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00))

PDF original: ES-2474573_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Medio de cultivo celular sin oligopïptidos

Campo de la invenciïn La presente invenciïn se refiere a medios de cultivo celular sin oligopïptidos que comprenden al menos 0, 5 mg/l de una poliamina y a procedimientos para cultivar cïlulas en dichos medios de cultivo celular sin oligopïptidos que comprenden al menos 0, 5 mg/l de una poliamina. La invenciïn tambiïn se refiere a procedimientos para expresar al menos una proteïna en un medio que comprende al menos 0, 5 mg/l de una poliamina y a procedimientos para producir al menos un virus en un medio que comprende al menos 0, 5 mg/l de una poliamina.

Antecedentes de la invenciïn Para el cultivo de cïlulas, particularmente cïlulas eucariotas, y mïs especïficamente cïlulas de mamïfero, hay una necesidad constante de usar medios de cultivo especiales que proporcionen las sustancias nutrientes que se requieren para el crecimiento eficaz de las cïlulas y para la producciïn de productos biolïgicos, especialmente productos biofarmacïuticos, tales como, por ejemplo, proteïnas recombinantes, anticuerpos, virus, antïgenos vïricos y partïculas similares a virus. Para la producciïn eficaz de dichos productos biolïgicos es importante lograr una densidad celular ïptima, ademïs de un aumento de la propia expresiïn de proteïnas con el fin de obtener el mïximo rendimiento de productos.

Las formulaciones de medios de cultivo celular se han enriquecido con una variedad de aditivos, que incluyen componentes indefinidos de suero bovino fetal (SBF) , varias proteïnas derivadas de animales y/o hidrolizados de proteïnas de origen bovino, ademïs de hidrolizados de proteïnas derivados de plantas o levadura.

En general, el suero o las sustancias basadas en suero tales como, por ejemplo, albïmina, transferrina o insulina, pueden comprender agentes no deseados que pueden contaminar los cultivos celulares y los productos biolïgicos obtenidos de los mismos. Ademïs, los aditivos derivados de suero humano tiene que probarse para todos los virus conocidos, que incluyen virus de la hepatitis y VIH, que pueden transmitirse mediante el suero. Ademïs, el suero bovino y los productos derivados del mismo poseen el riesgo de contaminaciïn por EEB. Ademïs, todos los productos derivados del suero pueden estar contaminados por sustancias desconocidas. Si se usa suero o aditivos de proteïna derivados de fuentes humanas o animales en cultivo celular, hay numerosos problemas (por ejemplo, la calidad variable en la composiciïn de diferentes lotes y el riesgo de contaminaciïn con micoplasma, virus o EEB) ,

particularmente si las cïlulas se usan en la fabricaciïn de fïrmacos o vacunas para administraciïn humana.

Por tanto, se han hecho muchos intentos para proporcionar sistemas huïsped y condiciones de cultivo eficaces que no requieran suero u otros compuestos de proteïna animal.

Tales medios libres de suero se han desarrollado basïndose en extractos de proteïna derivados de plantas o levadura. Por ejemplo, los hidrolizados de soja son conocidos por ser ïtiles para los procedimientos de fermentaciïn y pueden potenciar el crecimiento de muchos organismos, levaduras y hongos molestos. El documento WO 96/26266 describe que los digestos papaicos de harina de soja son una fuente de hidratos de carbono y nitrïgeno y muchos de los componentes pueden usarse en cultivo de tejido. Franek y col. (Biotechnology Progress (2000) 16,

688 -692) describen los efectos promotores del crecimiento y la productividad de fracciones definidas de pïptidos de hidrolizados de soja y de trigo.

El documento WO 96/15231 desvela un medio sin suero compuesto de un medio esencial mïnimo sintïtico y un extracto de levadura para la propagaciïn de cïlulas de vertebrado y un procedimiento de producciïn de virus. Una formulaciïn de medio compuesta de un medio de cultivo celular basal que comprende un pïptido de arroz y un extracto de levadura y un digesto enzimïtico de la misma, y/o un lïpido de planta para el crecimiento de cïlulas animales, se desvela en el documento WO 98/15614. Un medio que comprende hidrolizado de soja purificado para el cultivo de cïlulas recombinantes se desvela en el documento WO 01/23527. El documento WO 00/03000 desvela un medio que comprende un hidrolizado de soja y un extracto de levadura, pero tambiïn requiere la presencia de 55 formas recombinantes de proteïnas animales, tales como factores de crecimiento.

El documento EP-A-0 481 791 describe un medio de cultivo bioquïmicamente definido para cultivar cïlulas CHO manipuladas que estï libre de proteïna, lïpido e hidrato de carbono aislados de una fuente animal, que comprende ademïs una insulina recombinante o anïlogo de insulina, 1 % al 0, 025 % en peso/volumen de peptona y putrescina de soja digeridas con papaïna. El documento WO 98/08934 describe un cultivo celular eucariota sin suero que comprende pïptidos de soja hidrolizados (1 -1000 mg/l) , 0, 01 a 1 mg/l de putrescina y una variedad de componentes derivados de animal, que incluyen albïmina, fetuïna, diversas hormonas y otras proteïnas. En este contexto debe observarse que la putrescina tambiïn es conocida por estar comprendida en medios estïndar como DMEM/Ham's F12 en una concentraciïn de 0, 08 mg/l.

Sin embargo, los hidrolizados de planta y/o levadura son mezclas indefinidas de oligopïptidos y otros componentes y contaminantes desconocidos. Ademïs, la calidad de lotes comercialmente disponibles de hidrolizados varïa extremadamente. Como resultado, hay grandes variaciones en la producciïn de proteïnas recombinantes o productos vïricos (una variaciïn de hasta un factor de 3) en funciïn de los lotes de hidrolizados usados (“variaciïn lote a lote”) . Este inconveniente afecta a la proliferaciïn de las cïlulas, ademïs de la expresiïn de proteïnas de cada cïlula.

En resumen, los medios conocidos en el estado de la tïcnica se enriquecerïn con proteïnas o extractos de pïptidos derivados de animales, plantas o levadura; o con versiones recombinantes de proteïnas tales como, por ejemplo, insulina, factor de crecimiento similar a insulina u otros factores de crecimiento.

Por tanto, existe la necesidad de un medio de cultivo celular que estï libre de proteïnas y/u oligopïptidos animales, herbales y fïngicos con el fin de vencer los problemas anteriormente mencionados. Ademïs, existe una actual necesidad de aumentar el rendimiento de proteïnas recombinantes expresadas o cualquier otro producto de expresiïn, y de proporcionar un medio de cultivo celular ïptimo para la producciïn de productos biolïgicos, tales como aquellos usados como productos farmacïuticos o vacunas en seres humanos.

Resumen de la invenciïn Es un objetivo de la presente invenciïn proporcionar medios de cultivo celular sin oligopïptidos. Otro objetivo de la presente invenciïn es proporcionar procedimientos para cultivar cïlulas en dicho medio, ademïs de procedimientos para la expresiïn eficaz de proteïnas recombinantes y/o procedimientos para la producciïn eficaz de virus.

Es otro objetivo de la presente invenciïn eliminar hidrolizados derivados de animal, planta y/o levadura y proporcionar medios que no comprendan ninguna proteïna u oligopïptido complementario aïadido.

Sorprendentemente, la adiciïn de al menos 0, 5 mg/l de una poliamina a medio de cultivo celular proporciona un efecto ventajoso no solo promoviendo el crecimiento celular, sino tambiïn aumentando la expresiïn de proteïnas y/o virus por cïlula. Dicho efecto ventajoso inesperado puede lograrse incluso en medios sin oligopïptido.

Ademïs, el medio sin oligopïptido usado en un procedimiento segïn la presente invenciïn permite el coherente crecimiento celular y elevado rendimiento de productos deseados, particularmente de proteïnas diana... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de expresiïn de al menos una proteïna, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un cultivo de cïlulas;

(b) introducir al menos una secuencia de ïcidos nucleicos que comprende una secuencia que codifica al menos una proteïna seleccionada del grupo de factor VII de coagulaciïn, factor VIII de coagulaciïn, factor IX de coagulaciïn, vWF, ADAMTS 13 y furina en las cïlulas;

(c) seleccionar las cïlulas que llevan la secuencia de ïcidos nucleicos; y

(d) expresar la proteïna en las cïlulas en un medio sin oligopïptidos que comprende al menos 0, 5 mg/l de una

poliamina. 15

2. El procedimiento de la reivindicaciïn 1, en el que las cïlulas se cultivan por cultivo en quimiostato.

3. El procedimiento de la reivindicaciïn 1 ï 2, en el que las cïlulas son cïlulas CHO, cïlulas 293 o cïlulas BHK.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la combinaciïn de cïlulas/proteïna estï seleccionada del grupo que consiste en cïlulas CHO/factor VIII de coagulaciïn, cïlulas CHO/factor VII de coagulaciïn, cïlulas CHO/ADAMTS 13, cïlulas CHO/furina, cïlulas 293/factor IX de coagulaciïn.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la combinaciïn de cïlulas/proteïna es cïlula CHO/factor VIII de coagulaciïn, en el que el medio comprende Fe (II) y Cu (II) aïadidos y en el que la poliamina es putrescina.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la poliamina estï

seleccionada del grupo que consiste en cadaverina, putrescina, espermidina, espermina, agmatina, ornitina, y combinaciones de las mismas.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio comprende ornitina, putrescina o espermina, o combinaciones de las mismas. 35

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la poliamina se produce sintïticamente.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la poliamina estï presente 40 en el medio de cultivo en una concentraciïn que oscila de 0, 5 a 30 mg/l.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio estï quïmicamente definido.