Procedimiento y medio para el cultivo in vitro de embriones humanos.

Uso de FECGM humano para preparar un medio de propagación de embriones en su primera etapa hasta la fase de blastocito en un programa FIV

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/AU1999/000499.

Solicitante: ADELAIDE RESEARCH & INNOVATION PTY LTD.

Nacionalidad solicitante: Australia.

Dirección: 1st floor, 10-20 Pulteney Street Adelaide, S.A. 5000 AUSTRALIA.

Inventor/es: ROBERTSON,SARAH, WIKLAND,MATTS,F, SJOBLOM,CECILIA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/873 (Técnicas para producir nuevos embriones, p.ej. transferencia nuclear, manipulación de células totipotentes o producción de embriones de embriones quiméricos)
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Procedimiento y medio para el cultivo in vitro de embriones humanos.

Fragmento de la descripción:

Procedimiento y medio para el cultivo in vitro de embriones humanos.

La infertilidad es un motivo de gran preocupación para muchas parejas que desean concebir. La proporción de parejas que no pueden concebir naturalmente es notablemente elevada. En los EE.UU. se ha comentado que alrededor del 10-15% de las parejas en edad reproductiva no pueden tener hijos, mientas que, en el Reino Unido, la 5 proporción se ha calculado en un 14%.

En los 20 últimos años aproximadamente, se ha despertado una cierta esperanza para las parejas no fértiles, gracias al desarrollo de técnicas de fertilización in vitro (FIV) . Estas técnicas FIV adoptan en general la forma de estimulación de la mujer para que ovule, poner los óvulos recogidos en contacto con esperma in vitro e introducir los óvulos fertilizados en el útero. Existen también múltiples variaciones de este proceso general. A pesar de la intensa 10 investigación y de los avances técnicos en los campos de la FIV, el porcentaje de éxito en el embarazo después de tratamiento por FIV sigue siendo bastante bajo, siendo del orden del 15 al 25% por ciclo.

La iniciación de un programa de FIV provoca frecuentemente una notable ansiedad, especialmente cuando no se da el resultado esperado del embarazo. Se considera en la actualidad que el escaso porcentaje de éxito del tratamiento por FIV se debe a la tasa enormemente elevada de pérdida embrionaria precoz o fallo en la implantación 15 (Weinberg et al., 1988; Lenton et al., 1988) .

La escasa eficacia de la FIV, junto con su coste elevado y el trauma psicológico asociado a los fallos repetidos del tratamiento imponen la conveniencia de introducir mejoras en el procedimiento. Los métodos actuales para aumentar las tasas de embarazo durante el tratamiento por FIV incluyen la colocación de embriones múltiples (2-5) en la cavidad uterina. Esto no siempre tiene éxito, sin embargo lleva consigo un mayor riesgo de embarazos 20 múltiples.

En la mayoría de unidades de fertilización in vitro, los embriones se transfieren al útero 2 días después de la fertilización (4-8 células) . Hay quien considera que el uso de los embriones en esta etapa precoz podría contribuir notablemente al escaso resultado en embarazos de los programas de FIV, y que es más conveniente utilizar embriones en la etapa de blastocito que se alcanza al cabo de 5-7 días de cultivo. Las ventajas sugeridas incluyen 25 una mejor sincronización entre el embrión y el útero, y la capacidad para elegir embriones de mejor de calidad gracias al período de cultivo más prolongado. La transferencia de blastocitos podría ayudar igualmente a reducir el número de embarazos múltiples resultantes de la FIV, ya que permite la elección de un menor número de embriones altamente competentes por transferencia.

Desgraciadamente, en los medios normales de cultivo, la mayoría de embriones (alrededor del 75%) no 30 consiguen desarrollarse más allá de la etapa de 4-8. No obstante, con determinadas indicaciones clínicas, la implantación de embriones humanos se realiza en la etapa del blastocito, a pesar de la escasa proporción de embriones que alcanzan la etapa de blastocito. Algunos estudios recientes han utilizado técnicas de co-cultivo en las que los embriones se cultivan simultáneamente con células alimentadoras, por ejemplo células de Vero, técnica que puede aumentar en más del doble los índices de formación de blastocitos (Ménézo et al., 1990; Plachot et al., 1995) 35 . Se han publicado una serie de estudios que utilizan estas técnicas de co-cultivo, y que han demostrado un aumento del índice de implantación después de transferencia del blastocito (Ménézo et al., 1992) , particularmente en mujeres con fallos repetidos de las implantaciones anteriores (Oliveness et al., 1955; Plachot et al., 1955) .

El co-cultivo obliga a emplear mucho tiempo y es costoso, y se han expresado ciertas preocupaciones en cuanto a la posible transferencia de enfermedades de cultivos contaminados (Oliveness et al., 1955) . En particular, 40 preocupa especialmente la posibilidad de contaminación vírica, la cual se considera prácticamente imposible de eliminar del todo. Un enfoque más seguro y práctico sería el intento de producir un medio de cultivo que sea capaz de sostener el desarrollo del embrión hasta la etapa de blastocito de manera independiente al co-cultivo.

Otro planteamiento para mejorar el desarrollo del embrión in vitro sin el uso de técnicas de co-cultivo consiste en el intento de definir los factores que podrían utilizarse para mejorar el desarrollo del embrión en el cultivo in vitro. 45 Se han efectuado ya una serie de intentos para identificar los factores que podrían ayudar a ello, y entre los más prometedores se encuentran diversos factores estimuladores conocidos como citocinas. Uno de estos factores, el factor inhibidor de la leucemia (FIL) ha sido ya indicado como eficaz a este respecto en los humanos (Dunglison et al., 1996) y en algunas especies de ganado, véase la memoria de Patente EE.UU. 5418159.

Uno de los muchos factores que actualmente se encuentran también en investigación, tanto en animales 50 como en humanos, en relación con la concepción y el desarrollo del embrión es el factor estimulador de las colonias de granulocitos-macrófagos (FEC-GM) . No obstante, hasta la fecha no existen pruebas definitivas de que un medio suplementado con el FEC-GM sería suficiente para mejorar el desarrollo in vitro de los embriones hasta la etapa de blastocito en un determinado medio de cultivo.

El factor FEC-GM es una glucoproteína de 23-29 kD que, aunque se secreta en forma soluble in vitro, es una 55 de las muchas citocinas que se sabe que quedan secuestradas e inmovilizadas en la MEC (matriz extracelular) in vivo por asociación con el sulfato de heparán. Al principio, el FEC-GM se consideraba un regulador hemopoyético y determinante de la maduración y comportamiento de los leucocitos mieloides en tejidos periféricos. Se sabe actualmente que el FEC-GM lo producen una variedad de tipos de células, incluidos los linfocitos-T, monocitos, macrófagos, fibroblastos, células endoteliales y células epiteliales.

El epitelio uterino se ha identificado por hibridización in situ y en estudios de aislamiento de células in vitro 5 como una importante fuente de FEC-GM en el útero del ratón (Robertson et al., 1992, Robertson et al, 1994) y en el oviducto y el útero humanos (Zhao y Chegini 1994, Giacomini et al. 1995) . Algunos estudios que perturbaban el entorno de la citocina durante el embarazo precoz in vivo (Tartakovsky y Ben Yair, 1991) y varios experimentos que demostraron la pérdida de fertilidad en ratones genéticamente deficientes del FEC-GM (Robertson et al. 1999) apoyaron el papel claro del factor FEC-GM en los procesos reproductivos. 10

Algunos estudios de aglutinación de ligandos radio-marcados demuestran claramente que los blastocitos de ratón fijan específicamente el FEC-GM/125, indicando que expresan al menos la forma de menor afinidad del receptor del FEC- GM. Esta conclusión quedó confirmada por análisis RT-PCR, que demostró que los blastocitos expresan el ARNm para la subunidad α del complejo de receptores del factor FEC-GM. Se comprobó que en los embriones humanos se producía una situación similar. El FEC-GM-R se expresaba a niveles similares a lo largo de los cuatro 15 primeros días de desarrollo de embriones murinos (de ratón) y humanos, desde la fertilización hasta la etapa de formación del blastocito. No obstante, con la técnica RT-PCR no pudo detectarse el ARNm de la subunidad β del complejo de receptores FEC-GM en ninguna de las dos especies. En conjunto, estos datos sugieren que los embriones expresan el receptor FEC-GM al menos ya desde la fecundación, pero que podría ser de una...

 


Reivindicaciones:

1. Uso de FEC-GM humano para preparar un medio de propagación de embriones humanos en su primera etapa hasta la fase de blastocito en un programa FIV.

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque el FEC-GM humano se encuentra en forma purificada.

3. Uso según la reivindicación 2, caracterizado porque el FEC-GM humano se purifica a partir de una fuente no animal y no humana. 5

4. Uso según la reivindicación 3, caracterizado porque el FEC-GM humano se purifica a partir de un microorganismo recombinante.

5. Uso según la reivindicación 2, caracterizado porque el FEC-GM humano no es totalmente nativo y se encuentra modificado o alterado.

6. Uso según la reivindicación 5, caracterizado porque el FEC-GM humano está modificado o alterado en uno 10 o más de los aspectos seleccionados entre truncamiento, supresión de aminoácidos, sustitución de aminoácidos y recombinación molecular con otro factor de crecimiento.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el nivel de FEC-GM humano en el medio se encuentra entre 0, 01 ng/ml y 5 ng/ml.

8. Uso según la reivindicación 7, caracterizado porque el nivel de FEC-GM humano en el medio es de 0, 01 15 ng/ml.

9. Uso según la reivindicación 7, caracterizado porque el nivel de FEC-GM humano en el medio es de 2 ng/ml.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el medio es un medio carente de suero.

11. Uso según la reivindicación 10, caracterizado porque el medio carente de suero incluye componentes 20 derivados del suero que han sido purificados sustancialmente de suero.

12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque el medio es un medio perfectamente definido.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque la propagación de embriones humanos incluye la etapa de incubar los embriones in vitro en el medio que contiene el FEC-GM humano 25 durante el tiempo y en las condiciones necesarios para aumentar la proporción de blastocitos preparados para su transferencia.

14. Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque los embriones se ponen en contacto con el factor FEC-GM en una etapa precoz.

15. Uso según la reivindicación 14, caracterizado porque la etapa precoz de los embriones va desde 30 inmediatamente después de la fecundación, hasta varios días después de la misma.

16. Uso según la reivindicación 15, caracterizado porque la etapa precoz de los embriones es de menos de 4 días.

17. Uso según la reivindicación 16, caracterizado porque el contacto se realiza dentro de los 2 días siguientes a la fecundación. 35

18. Uso según la reivindicación 15, caracterizado porque el crecimiento in vitro se continúa hasta que l os blastocitos alcanzan la etapa de los días 5 a 6.

19. Uso según la reivindicación 18, caracterizado porque los embriones se cultivan en el medio que contiene el FEC-GM humano hasta que se alcanza la etapa de blastocito, y acto seguido se transfieren a un segundo medio que contiene FEC-GM humano para continuar su cultivo. 40

20. Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque los embriones se incuban al menos después de que se ha formado el embrión en la etapa de 8 células.