Procedimiento para la medida de iones de calcio.

Un procedimiento para determinar la concentración de los iones de calcio en una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de

a) mezclar la muestra con una solución que comprende un compuesto de fórmula I**Fórmula**

en la que R1 se selecciona de hidrógeno, halógeno, carboxi, alquilo y formilo, R2 se selecciona independientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo, alcoxi, morfolino, CN, carboxi y formilo, R3 se selecciona independientemente de hidrógeno, halógeno, N-alquilsulfato, carboxi, alcoxi, fenilo, CN, CF3, y terc-butilo, R4 se selecciona independientemente hidrógeno, halógeno o alquilo, R5 y R7 son independientemente hidrógeno o alquilo, R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo, alcoxi y halógeno, o en la que R3 y R4 forman un puente aromático y X+ es un contraión cargado positivamente,

uniendo de este modo los iones de calcio al compuesto

b) liberar los iones de calcio del compuesto, en el que dicha liberación provoca un cambio en la absorbancia del compuesto

c) medir el cambio en la absorbancia

d) usar el cambio en la absorbancia medida en

(c) para determinar la concentración de los iones de calcio.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2011/054713.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Inventor/es: JOSEL, HANS-PETER, Kytzia,Hans-Joachim, MUECKE,MATTHIAS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/84 (en los que intervienen compuestos inorgánicos o el pH)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > COLORANTES; PINTURAS; PULIMENTOS; RESINAS NATURALES;... > COLORANTES ORGANICOS O COMPUESTOS ESTRECHAMENTE RELACIONADOS... > C09B11/00 (Colorantes de diaril o triarilmetano)

PDF original: ES-2532991_T3.pdf

 

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Procedimiento para la medida de iones de calcio.

Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la medida de iones de calcio Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un reactivo para la determinación de calcio y a un procedimiento de determinación usando ese reactivo. Más en particular, se refiere a un reactivo para la determinación de calcio que comprende un quelante de tipo BAPTA mono-nitro sustituido (BAPTA = ácido 1,2-bis(2-am¡nofenoxl)etano-N,N,N,N-tetraacét¡co). Un procedimiento de determinación que permite una determinación precisa de calcio en una muestra, tal como una muestra de sangre (por ejemplo, sangre completa, plasma o suero) o cualquier otra muestra líquida acuosa (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, linfa, saliva u orina) y, por tanto, es especialmente útil para diagnósticos clínicos, como se describe.

Los niveles de calcio en sangre o suero, respectivamente, son de un valor de diagnóstico significativo y pueden tener implicaciones en el tratamiento importantes.

El intervalo de referencia para los iones de calcio es muy estrecho, de 2,2 a 2,55 mmol/l, y ligeras desviaciones por encima y por debajo de estos niveles son diagnósticos de varios trastornos fisiológicos. Las dos enfermedades más comunes asociadas con la hipercalcemia (calcio en suero elevado) son el hiperparatiroidismo y la neoplasia maligna, en especial cuando la neoplasia maligna ha metastatizado al esqueleto y ha provocado la resorción ósea (es decir, destrucción local del hueso acompañada de la liberación de calcio desde el sitio de la lesión metastásica). La disminución en los niveles de calcio en suero (hipocalcemia) está asociada comúnmente con el hipoparatiroidismo. Aproximadamente un 1 % de los recién nacidos tienen una hipocalcemia significativa (calcio en suero <1,75 mmol/l) con síntomas tales como irritabilidad, espasmos y convulsiones, lo que requiere una intervención médica inmediata.

El magnesio, como el calcio, es uno de los elementos principales que se encuentran en el cuerpo. Las alteraciones en el nivel de magnesio también dan lugar a síntomas clínicos, de los que algunos son muy parecidos a los que se encuentran con niveles alterados de calcio. Dados los síntomas clínicos prácticamente idénticos del bajo nivel de calcio en suero y del bajo nivel de magnesio en suero, es imperativo definir qué elemento es el que provoca los síntomas clínicos. A menudo, ambas medidas de calcio y magnesio en suero son necesarias para determinar qué elemento está, o según sea el caso, si ambos elementos están, fuera del intervalo normal y es imperativo que el magnesio no interfiera con la cuantificación de calcio.

El procedimiento de referencia para medir calcio y magnesio, respectivamente, es la absorción atómica. Para medidas rutinarias, la absorción atómica es un poco inconveniente, requiere instrumentos caros y un operario algo experto que realice los ensayos con el fin de lograr una precisión y reproducibilidad suficientes.

La actividad catalítica de determinadas enzimas depende fuertemente de la presencia de iones de calcio, haciendo posible de este modo cuantificar el calcio por medio de una medida de la actividad enzimática dependiente de calcio. Los procedimientos para la medida de iones de calcio en base a procedimientos enzimáticos se han descrito, por ejemplo, en el documento US 6.68.971.

Con frecuencia, los procedimientos actuales usados en la rutina de los laboratorios clínicos para medir el calcio se basan en procedimientos que emplean agentes productores de color, quelantes, como orto-cresolftaleína-complexona (o-CPC), arsenazo III, fosfonazo o clorofosfonazo. Aunque al menos uno de estos procedimientos se usa a menudo en la rutina clínica de un laboratorio, cada uno tiene desventajas.

La sensibilidad de los procedimientos con o-CPC es muy dependiente del pH. Para una sensibilidad máxima, la reacción se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 1,7. A estos valores de pH alcalinos, sin embargo, el reactivo absorbe fácilmente el dióxido de carbono ambiental. La absorción de dióxido de carbono que se combina con agua para formar ácido carbónico reduce gradualmente el pH del reactivo y finalmente hace que el reactivo sea no funcional para las medidas de calcio. El cambio gradual en el pH también requiere ciclos de calibrado más frecuentes con el fin de asegurar una medida correcta. Además, o-CPC es más bien no selectivo y se une al magnesio y a otros metales, como gadolinio. Para eliminar la Interferencia con magnesio en los niveles que se encuentran normalmente en suero, se añade 8-hidroxiquinolina para quelar el magnesio.

Los procedimientos para la detección de calcio basados en arsenazo III no sufren los problemas de pH alto e interferencia con magnesio (dependiendo del pH de la medida) Inherentes en los procedimientos con o-CPC. El arsenazo III se une al calcio bajo condiciones débilmente ácldas, por ejemplo pH 5 a 6, y si la medida de calcio se realiza a un pH menor de 7, la unión de magnesio es despreciable. Aunque el arsenazo III elimina muchas de las desventajas de los procedimientos con o-CPC, sufre de sensibilidad más bien baja y de preocupaciones ambientales. Cada mol de arsenazo III contiene 2 moles de arsénico, y la eliminación de los reactivos con arsenazo III es un asunto crítico en muchos países debido a los problemas de contaminación del suministro de agua con arsénico.

El documento JP-A-4-12464 divulga que el calcio y el magnesio se pueden cuantiflcar al mismo tiempo usando cloro-fosfonazo-lll como un agente quelante y productor de color. En el caso de clorofosfonazo-lll, el Intervalo de pH más adecuado para su cambio de color es débilmente ácido y el clorofosfonazo-lll es un reactivo que no contiene arsénico. Por lo tanto, el clorofosfonazo-lll es ventajoso con respecto a los problemas provocados por un alto pH y la toxicidad. Sin embargo, la cuantificación simultánea de magnesio y calcio usando clorofosfonazo-lll plantea un problema. Normalmente, este quelante se añade a una muestra para unirse tanto al magnesio como al calcio provocando de este modo la coloración. A continuación, se añade EGTA para liberar únicamente el calcio unido, provocando esta liberación un cambio en el color. Después, se cuantifica el calcio en base al cambio en el color. El clorofosfonazo-lll tiende además a dar valores del blanco altos, este hecho limita el intervalo de concentración en el que es posible la determinación de los iones de calcio.

Se han descrito y usado agentes quelantes de cal de tipo BAPTA como sistemas de tampón para controlar, por ejemplo, la concentración de iones de calcio intracelulares. Pethlg, R. y col., (Cell Calcium 1 (1989) 491-498) han determinado las constantes de disociación de siete tampones de calcio de tipo BAPTA diferentes. Proponen el uso de dibromo-BAPTA en los trabajos fisiológicos con calcio.

Como se analiza anteriormente, en la rutina clínica son conocidos varios procedimientos de ensayo para la medida de los iones de calcio. Están disponibles varios reactivos para la determinación de calcio basados en el uso de un agente quelante y productor de color, dejando espacio cada uno para una mejora adicional.

Por tanto, hay necesidades no cubiertas de los reactivos y de los procedimientos para medir cuantitativamente el calcio en muestras analíticas. El procedimiento ideal se debe basar en un quelante que a) sea estable bajo condiciones de almacenamiento y a bordo de un analizador, b) no contenga elementos tóxicos, como por ejemplo arsénico, c) tenga una absorbancia del blanco del reactivo relativamente baja, d) no se una a los Iones de magnesio ni a otros iones de metales, como gadolinio, e) permita determinaciones rápidas y un rendimiento de muestra alto, y f) dé lugar a una medida precisa de los iones de calcio sobre un intervalo de medida amplio.

Sorprendentemente,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para determinar la concentración de los iones de calcio en una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de

a) mezclar la muestra con una solución que comprende un compuesto de fórmula I Fórmula I

x+ x+

**(Ver fórmula)**

en la que R1 se selecciona de hidrógeno, halógeno, carboxi, alquilo y formilo, R2 se selecciona independientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo, alcoxl, morfolino, CN, carboxi y formilo, R3 se selecciona independientemente de hidrógeno, halógeno, N-alquilsulfato, carboxi, alcoxi, fenilo, CN, CF3, y tere-butilo, R4 se selecciona independientemente hidrógeno, halógeno o alquilo, R5 y R7 son Independientemente hidrógeno o alquilo, R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo, alcoxi y halógeno, o en la que R3 y R4 forman un puente aromático y X+ es un contraión cargado positivamente,

uniendo de este modo los iones de calcio al compuesto

b) liberar los iones de calcio del compuesto, en el que dicha liberación provoca un cambio en la absorbancia del compuesto

c) medir el cambio en la absorbancia

d) usar el cambio en la absorbancia medida en (c) para determinar la concentración de los iones de calcio.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la solución que comprende el compuesto de fórmula I tiene un pH en el intervalo de pH 8,5 a pH 11,5.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la solución que comprende el compuesto de fórmula I tiene un pH en el intervalo de pH 9, a pH 1,5.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R1 de la fórmula I es hidrógeno o bien halógeno.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R2 de la fórmula I es hidrógeno, halógeno o alquilo.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R3 de la fórmula I es hidrógeno, halógeno, carboxi o alcoxi.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la liberación de los iones de calcio en la etapa (b) de la reivindicación 1 está desencadenada por un agente quelante de calcio que tiene a 2 °C una constante de unión para los iones de calcio de log k igual a 7, o superior.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la liberación de los iones de calcio en la etapa (b) de la reivindicación 1 está desencadenada por EDTA, DTPA, EGTA, DTPMP y/o EDPMP.

9. Un reactivo para la medida de calcio que tiene un pH que varía de pH 8,5 a pH 11,5, que contiene un compuesto de fórmula I como se define en la reivindicación 1.

1. El reactivo de la reivindicación 9, que comprende el compuesto de fórmula I en una concentración que varía de

,1 mM a 5 mM.

11. El reactivo de la reivindicación 9, que comprende un sistema de tampón, en el que el sistema de tampón se selecciona de AMPD (= 2-amino-2-metil-1,3-propanod¡ol), CHES (= ácido 2-(N-ciclohexilam¡no)-etanosulfón¡co),

AMPSO (= ácido 3-[d¡met¡l(h¡droxilmetil)-metilamino]-2-h¡drox¡propanosulfónico), CAPSO (= ácido (3-ciclohex¡lamino)-2-hidroxi-1-propanosulfónico), CAPS (= ácido (3-ciclohexilam¡no)-2-propanosulfónico), un sistema de tampón de glicina, o un sistema de tampón de carbonato.

12. El reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que R1 de la fórmula I es hidrógeno o 15 bien halógeno.

13. El reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que R2 de la fórmula I es hidrógeno, halógeno o alquilo.

14. El reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que R3 de la fórmula I es hidrógeno,

halógeno, carboxi o alcoxi.

15. Un kit de prueba para la medida de calcio, comprendiendo el kit de prueba el reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.