Mediadores específicos de secuencia de ARN de interferencia de ARN.

Un procedimiento de mediación en la interferencia por ARN del ARNm de un gen en un organismo no humano que comprende:

a) introducir el ARN bicatenario de 21 a 23 nucleótidos que se dirige al ARNm del gen para su degradación en el organismo no humano;

b) mantener el organismo no humano producido en (a) en las condiciones en que se produce la degradación del ARNm, mediando de este modo la interferencia por ARN del ARNm del gen en el organismo no humano.

a condición de que el procedimiento no sea un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal por cirugía o terapia, o un procedimiento de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal

Mediadores específicos de secuencia de ARN de interferencia de ARN Antecedentes de la invención

La interferencia por ARN o ¡ARN es un término inicialmente acuñado por Fire y colaboradores para describir la observación de que el ARN bicatenario (ARNbc) puede bloquear la expresión génica cuando se introduce en gusanos (Fire et al. (1998) Nature 391, 806-811). El ARNbc dirige el silenciamiento postranscripcional, específico de genes en muchos organismos, incluyendo vertebrados y ha proporcionado una nueva herramienta para el estudio de la función génica. La ¡ARN implica la degradación del ARNm, pero se desconocen muchos de los mecanismos bioquímicos subyacentes a esta interferencia. Se necesita la recapitulación de las características principales de la ¡ARN in vitro para el análisis bioquímico del fenómeno.

Sumario de la invención

La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Se describe en el presente documento interferencia mediada por ARNbc, específica de genes en un sistema libre de células derivado de embriones de Drosophila blastodérmicos sincitiales. El sistema in vitro complementa enfoques genéticos para analizar minuciosamente la base molecular de la ¡ARN.

Como se describe en el presente documento, se examinaron los mecanismos moleculares subyacentes a la ¡ARN usando el sistema in vitro de Drosophila. Los resultados mostraron que la ¡ARN es dependiente de ATP aunque se desacople de la traducción del ARNm. Es decir, no se requiere la síntesis de proteínas para la ¡ARN in vitro. En la reacción de ¡ARN, ambas cadenas (sentido y antisentido) del ARNbc se procesan dando lugar a fragmentos o segmentos pequeños de ARN desde aproximadamente 21 hasta aproximadamente 23 nucleótidos (nt) de longitud (los ARN con movilidad en geles de secuenciación que corresponden a marcadores que son de 21-23 nt de longitud, denominados opcionalmente en lo sucesivo ARN de 21-23 nt). El procesamiento del ARNbc en fragmentos pequeños de ARN no requiere el ARNm seleccionado como diana, lo que demuestra que las especies pequeñas de ARN se generan mediante el procesamiento del ARNbc y no como un producto de degradación de ARNm dirigido por ARNbc. El ARN solo se escinde dentro de la región de identidad con el ARNbc. La escisión se produce en sitios separados en 21-23 nucleótidos, el mismo intervalo observado para el propio ARNbc, lo que sugiere que los fragmentos de 21-23 nucleótidos del ARNbc guían la escisión del ARNm. Esos ARN purificados de 21-23 nt que median en la ¡ARN confirman que estos fragmentos están guiando la escisión del ARNm.

Por consiguiente, en la presente memoria se describen moléculas de ARN aisladas (be) desde 21 hasta 23 nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 6 que median en la ¡ARN. Es decir, los ARN aislados de la presente invención median la degradación de ARNm de un gen al que corresponde el ARN (median en la degradación del ARNm que es el producto transcripcional del gen, que también se denomina en lo sucesivo gen diana). Por conveniencia, tal ARNm también se denomina en lo sucesivo en el presente documento ARNm que va a degradarse. Como se usa en el presente documento, los términos ARN, molécula(s) de ARN, segmento(s) de ARN y fragmento(s) de ARN se usan indistintamente para referirse al ARN que media en la interferencia por ARN. El ARN bicatenario es ARN aislado (ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de manera recombinante) y ARN alterado que difiere del ARN que se produce de manera natural mediante la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como al/a los extremo(s) del ARN de 21-23 nt o internamente (a uno o más nucleótidos del ARN). Los nucleótidos en las moléculas de ARN de la presente invención pueden comprender también nucleótidos no convencionales, incluyendo nucleótidos que no se producen de manera natural o desoxirribonucleótidos. Colectivamente, todos los ARN alterados se denominan en lo sucesivo análogos o análogos de ARN que se producen de manera natural. El ARNbc de 21-23 nucleótidos de la presente invención solo necesita ser suficientemente similar al ARN natural que tiene la capacidad para mediar (media) en la ¡ARN. Tal como se usa en el presente documento, la expresión media en la ¡ARN se refiere a (indica) la capacidad para distinguir que ARN van a degradarse mediante la maquinaria o el procedimiento de la ¡ARN. El ARN que media en la ¡ARN interactúa con la maquinaria de la ¡ARN de tal manera que dirige la maquinaria para degradar ARNm particulares. En una realización, la presente divulgación se refiere a las moléculas de ARN de 21 a 3 nucleótidos que dirigen la escisión del ARNm específico al que corresponde su secuencia. No es necesario que la correspondencia de las secuencias sea perfecta, sino que la correspondencia debe ser suficiente para permitir que el ARN dirija la escisión por ¡ARN del ARNm diana. En una realización particular, las moléculas de ARN de 21-23 nt de la presente divulgación comprenden un grupo hidroxilo en 3.

La presente divulgación también se refiere a procedimientos para producir moléculas de ARN de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos con capacidad para mediar la escisión por ¡ARN. En una realización, se usa el sistema in vitro de Drosophila. En esta realización, se combina el ARNbc con un extracto soluble derivado de embrión de Drosophila, produciendo de este modo una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en las que el ARNbc se procesa para dar moléculas de ARN de 21 a 23 nucleótidos de longitud. En otra realización, se usa el sistema in vitro de Drosophila para obtener secuencias de ARN de 21-23 nucleótidos que median en la interferencia por ARN del ARNm de un gen particular (por ejemplo, oncogén, gen viral). En esta realización, el ARN

bicatenario que corresponde a una secuencia del gen que va seleccionarse como diana se combina con un extracto soluble derivado del embrión de Drosophila, produciendo de este modo una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en las que el ARN bicatenario se procesa para dar lugar a ARN de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. Como se muestra en el presente documento, el ARN de 21-23 nt media en la ¡ARN del ARNm del gen seleccionado como diana (el gen cuyo ARNm va a degradarse). El procedimiento para obtener los ARN de 21-23 nt utilizando el sistema in vitro de Drosophila además puede comprender aislar la secuencia de ARN de la combinación.

La presente divulgación también se refiere a ARN be de 21-23 nt producido mediante los procedimientos divulgados en la presente invención, así como a los ARN de 21-23 nt, producidos mediante otros procedimientos, tales como síntesis química o técnicas de ADN recombinante, que tienen las mismas o substancialmente las mismas secuencias que los ARN producidos de manera natural que median en la ¡ARN, tales como los producidos mediante los procedimientos de la presente divulgación. Todos estos se denominan en lo sucesivo ARNbc de 21-23 nt que median en la interferencia por ARN. Como se usa en el presente documento, el término ARN aislado incluye el ARN obtenido mediante cualquier medio, incluyendo el procesamiento o escisión del ARNbc tal como se describe en el presente documento; la producción mediante procedimientos de síntesis química; y la producción mediante técnicas de ADN recombinante. La divulgación también se refiere a los usos de los ARN de 21-23 nt, tales como para el tratamiento terapéutico o profiláctico y para las composiciones que comprenden los ARN de 21-23 nt que median la ¡ARN, tales como las composiciones farmacéuticas que comprenden los ARN de 21-23 nt y un vehículo apropiado (por ejemplo, un tampón o agua).

La presente invención también se refiere a un procedimiento para mediar en la interferencia por ARN del ARNm de un gen en un organismo no humano (por ejemplo, un mamífero tal como un ratón ). En una realización, se introduce el ARNbc de 21 a 23 nt que se dirige al ARNm que va a degradarse en el organismo no humano. El organismo no humano se mantienen en las condiciones en que se produce la degradación del ARNm, mediando de este modo la interferencia por ARN del ARNm del gen en el organismo no humano. El procedimiento no es un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o de uncuerpo animal por cirugía o terapia o un procedimiento diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal. El organismo no humano puede ser uno en que se produce la ¡ARN según se obtiene I el organismo no humano o un organismo no huamno puede ser uno que se ha modificado de modo que se produzca la ¡ARN (por ejemplo,... [Seguir leyendo]

1.- Un procedimiento de mediación en la interferencia por ARN del ARNm de un gen en un organismo no humano que comprende:

a) introducir el ARN bicatenario de 21 a 23 nucleótidos que se dirige al ARNm del gen para su degradación en el organismo no humano;

b) mantener el organismo no humano producido en (a) en las condiciones en que se produce la degradación del ARNm, mediando de este modo la interferencia por ARN del ARNm del gen en el organismo no humano.

a condición de que el procedimiento no sea un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal

por cirugía o terapia, o un procedimiento de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal.

2.- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el gen codifica un ARNm celular o un ARNm viral.

3.- El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende, además las etapas de:

a) combinar el ARN bicatenario que corresponde a una secuencia del gen con un extracto soluble que media interferencia de ARN produciendo de este modo una combinación

b) mantener la combinación producida en (a) en condiciones en las que el ARN bicatenario se procesa para dar lugar a ARN bicatenario de 21 a 23 nucleótidos, produciendo de este modo el ARN bicatenario de 21 a 23 nucleótidos;

c) aislar el ARN bicatenario de 21 a 23 nucleótidos producido en (b). antes de las etapas (a), (b), y (c) del procedimiento de la reivindicación 1

4.- Un procedimiento para examinar la función de un gen en un organismo no humano, comprendiendo el procedimiento:

a) introducir ARN bicatenario de 21 a 23 nucleótidos que se dirige al ARNm del gen para la degradación en organismo no humano produciendo de este modo un organismo de prueba

b) mantener el organismo de prueba en condiciones en las que se produce la degradación del ARNm del gen, produciendo de este modo un organismo de pruebas en el que el ARNm del gen se degrada; y.

c) observar el fenotipo del organismo de prueba producido en (b), y opcionalmente, comparar el fenotipo observado con el de un organismo de control apropiados, proporcionando de este modo información sobre la función del gen;

a condición de que el procedimiento no sea un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal por cirugía o terapia, o un procedimiento de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal.

5.- El procedimiento de la reivindicación 4, que comprende, además, las etapas de;

a) combinar el ARN bicatenario que corresponde a una secuencia del gen con un extracto soluble que media en la interferencia de ARN, produciendo de este modo una combinación;

b) mantenerla combinación producida en (a) en condiciones en las que el ARN bicatenario se procesa para dar lugar a ARN bicatenario de 21 a 23 nucleótidos, produciendo de este modo el ARN bicatenario de 21 a 23 nucleótidos;

c) aislar el ARN bicatenario de 21 a 23 nucleótidos producido en (b); antes de las etapas (a), (b), y (c) del procedimiento de la reivindicación 4.

6.- El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el ARN bicatenerio de 21 a 23 nucleótidos comprende un grupo un grupo hidroxilo 3 terminal.

7.- Un procedimiento para evaluar si un producto génico es una diana apropiada para el descubrimiento de fármacos que comprende:

a) introducir el ARN bicatenario de 21 a 23 nucleótidos que se dirige al ARNm del gen para la degradación en un organismo no humano;

b) mantener el organismo no humano de (a) en condiciones en las que se produce la degradación del ARNm, dando como resultado la expresión disminuida del gen; y

c) determinar el efecto de la expresión disminuida del gen en el organismo no humano, en el que si la expresión disminuida tiene un efecto, entonces el producto génico es una diana para el descubrimiento de fármacos.

a condición de que el procedimiento no sea un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal por 5 cirugía o terapia, o un procedimiento de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal

8.- El procedimiento de la reivindicación 1, 4 o 7, en el que el ARN bicatenarlo de 21 a 23 nucleótidos es un ARN sintetizado químicamente o un ARN que incluye nucleótidos o desoxirribonucleótidos que no se dan en la naturaleza.

Pp-Luc / Rr-luz

Fig. 1

Fig. 2A

Fig. 2B

QUE QUEDA

Rl

F¡g.5C

Fig.6