Materiales y procedimientos relacionados con estrategias de vacunación mejoradas.

Una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2.

Materiales y procedimientos relacionados con estrategias de vacunación mejoradas.

La presente invención se refiere a materiales y procedimientos para mejorar las estrategias de vacunación. En particular, pero no exclusivamente, la invención se refiere a protocolos de vacunación de "sensibilización-refuerzo" en los que el sistema inmunitario es inducido por una composición de sensibilización y reforzado mediante la administración de una composición de refuerzo.

Los recientes avances en la capacidad para el seguimiento de la frecuencia de las respuestas de CTL a antígenos en ensayos ex vivo están mejorando rápidamente la capacidad para comparar diferentes protocolos de vacunación. En particular, el uso de complejos tetrámeros solubles de MHC de clase I/péptido (tetrámeros) proporciona una oportunidad para acelerar mucho el desarrollo de nuevas vacunas permitiendo el análisis rápido y preciso de respuestas de CTL humanos 1-3 .

Ha quedado claro que los protocolos de vacunación de sensibilización-refuerzo heterólogos, basados en inyecciones repetidas de vectores sin reacciones cruzadas, que codifican la misma proteína antígena, dan como resultado respuestas de CTL fuertes, probablemente debidas a la concentración de la respuesta inmunitaria hacia los epítopos contenidos en las proteínas diana recombinantes 4. Resultados recientes han demostrado que la combinación de sensibilización con ADN plasmídico y el refuerzo con virus vaccinia defectuosos recombinantes MVA genera niveles altos de inmunidad específica 5-10 .

Los alfavirus se han estudiado ampliamente como vectores víricos en protocolos de vacunación 11-15. El alfavirus incompetente para la replicación, virus del bosque de Semliki (SFV) , ha demostrado ser capaz de inducir anticuerpos y CTL dirigidos contra los antígenos extraños codificados 14, 15. El pequeño tamaño del genoma del SFV16, hace que este virus sea muy atractivo para las estrategias de vacunación, ya que la expresión de un número pequeño de proteínas estructurales víricas maximiza las posibilidades de generar una respuesta inmunitaria específica contra las proteínas recombinantes, más que contra las proteínas estructurales víricas.

Varios estudios han demostrado que los virus y las células tumorales eluden respuestas inmunitarias específicas mutando o eliminando proteínas antígenas 17, 18. Con el fin de minimizar la generación de variantes de virus o tumores con pérdida de antígeno, las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna deben ser específicas para una amplia variedad de epítopos diferentes, posiblemente codificados por diferentes proteínas. Este razonamiento ha conducido a la generación de vacunas que codifican cadenas de epítopos de CTL, dirigidas a aumentar simultáneamente CTL con diferente especificidad. La vacunación de ratones transgénicos A2 ha mostrado que múltiples epítopos codificados en construcciones de poliepítopos, pueden sensibilizar cada uno CTL específicos, lo que sugiere la viabilidad de este procedimiento para ensayos clínicos de inmunoterapia 19-22. Sin embargo, debido a las limitaciones técnicas de los ensayos para el seguimiento directo de las respuestas de CTL en estos ratones, faltan pruebas de que las construcciones polivalentes sean capaces de aumentar los CTL de muchas especificidades a niveles eficaces.

Hay esperanza de que las vacunas de poliepítopos serán capaces de inducir respuestas amplias basadas en linfocitos T citotóxicos (CTL) en seres humanos. La administración de una pluralidad de epítopos está dirigida al aumento simultáneo de CTL con diferente especificidad. Aunque dichas construcciones polivalentes han demostrado ser capaces de sensibilizar simultáneamente CTL de múltiples especificidades en animales, lo cual es claramente ventajoso, sigue sin estar claro si son capaces de reforzar posteriormente cada una de estas respuestas de CTL en niveles eficaces.

Se sabe que algunos epítopos son más eficaces en la producción de una respuesta inmunitaria que otros. Algunos epítopos se pueden describir como dominantes, es decir, provocan una respuesta de CTL fuerte, mientras que otros se pueden describir como subdominantes, ya que provocan una respuesta más débil. Sin embargo, cuando se intenta producir una respuesta inmunitaria contra una amplia variedad de epítopos, es importante que los epítopos subdominantes no se ignoren en favor de los epítopos más dominantes.

Durante la etapa de sensibilización de un régimen de vacunación, los epítopos más dominantes provocan una respuesta de CTL mayor que los epítopos más débiles. Esto significa que después de un suceso de sensibilización inicial contra una pluralidad de epítopos, la respuesta de CTL es inevitablemente mayor para las especies más dominantes y menor para las especies subdominantes. Sin embargo, los autores de la presente invención han encontrado que la situación empeora cuando la misma pluralidad de epítopos se administra como una construcción de poliepítopos durante la fase de refuerzo. Parece que esto es cierto incluso cuando el poliepítopo se proporciona en un vector/vehículo diferente que el de la fase de sensibilización. Los autores de la invención han encontrado que durante la etapa de refuerzo, la respuesta de CTL contra los epítopos más dominantes aumenta a una velocidad mayor que la respuesta de CTL contra el epítopo subdominante, en la medida en que el aumento de la respuesta de CTL contra los epítopos subdominantes es significativamente menor. Esto significa que los CTL producidos contra los epítopos dominantes aumentan más a expensas de los CTL producidos contra los epítopos subdominantes. Como consecuencia, la proporción de CTL producidos contra los epítopos dominantes aumenta mientras que la proporción de los CTL producidos contra los epítopos subdominantes solo aumenta ligeramente. Esto significa que la fase de refuerzo estrecha la respuesta inmunitaria en favor de la proliferación de CTL aumentados en la etapa de sensibilización inicial.

Los autores de la presente invención han determinado sorprendentemente un nuevo régimen de sensibilización-refuerzo que ayuda a superar el efecto potencialmente negativo de la fase de refuerzo en una pluralidad de epítopos dominantes y subdominantes.

Notablemente, los autores de la invención han encontrado que se puede reforzar de forma más uniforme a niveles eficaces una respuesta de CTL amplia si, después de la etapa de sensibilización, los epítopos se usan individualmente para reforzar la respuesta en contraposición a ser administrados como una sola construcción de poliepítopos. Mediante el refuerzo con los epítopos individuales, los autores de la invención han encontrado que los CTL producidos contra los epítopos dominantes no son reforzados a expensas de los CTL producidos contra los epítopos subdominantes. Sino que son reforzados igualmente.

Específicamente, y como se ilustra más adelante, los autores de la invención han usado ADN y vectores víricos que codifican una cadena de epítopos de melanoma, para demostrar que las vacunaciones de sensibilización-refuerzo dan como resultado el aumento de un repertorio estrecho de CTL. En la etapa de refuerzo, los autores de la invención encontraron que la competición de CTL para el reconocimiento de células presentadoras de la construcción de poliepítopos favorece la respuesta hacia los CTL que han aumentado más eficazmente durante la sensibilización. A diferencia de esto, los autores de la invención han encontrado que se obtiene el aumento simultáneo de los CTL específicos contra determinantes dominantes y subdominantes cuando las APC presentaban los epítopos por separado durante la fase de refuerzo. Esto se podía lograr, por ejemplo, por inyección de una mezcla de virus que codifique cada uno un antígeno separado, o por inyección de una mezcla de APC presentadoras de los epítopos por separado.

Por lo tanto, la invención proporciona materiales para inducir una respuesta basada en CTL específica pero amplia contra una pluralidad de epítopos, en la que se usa la construcción de poliepítopos Mel3 (Tabla 1) en la fase de sensibilización de un régimen de vacunación, pero se usan inmunógenos que codifican o comprenden los epítopos individualmente para la fase de refuerzo.

La invención proporciona además una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la construcción Mel3 mostrada en la tabla 1.

La invención proporciona además una secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia... [Seguir leyendo]

1. Una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2.

2. Una secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 1.

3. Un plásmido de ADN que comprende una secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2.

4. Un vector de expresión de ácido nucleico que comprende la secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 1 o reivindicación 2.

5. Un vector vírico que comprende la secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 1 o reivindicación

2.

6. Un vector vírico de acuerdo con la reivindicación 5, que se selecciona del grupo que consiste en vector adenovírico, vector del virus Herpes simple, vector del virus vaccinia, vector del virus de la viruela aviar y vector de alfavirus.

7. Un vector vírico de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho vector alfavirus es el vector del virus del bosque de Semliki.

8. Un virus vaccinia Ankara modificado recombinante (MVA) que comprende la secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 1 o reivindicación 2.

9. Un plásmido de ADN de acuerdo con la reivindicación 3, para usar en un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria de CD8+ contra antígenos asociados a melanoma en un sujeto.

10. Un virus MVA recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, para usar en un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria de CD8+ contra antígenos asociados a melanoma en un sujeto.

11. Un virus MVA recombinante de acuerdo con la reivindicación 10, en el que a dicho sujeto se le ha administrado previamente un plásmido de ADN de acuerdo con la reivindicación 3.

12. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO. 2.

13. Una célula que comprende el polipéptido de la reivindicación 12.

14. Una célula de acuerdo con la reivindicación 13, en la que dicha célula es una célula presentadora de antígeno.

15. Una célula de acuerdo con la reivindicación 14, en la que dicha célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica o un linfocito.

16. Un vector de expresión de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 4 a 7, para usar en un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria de CD8+ contra antígenos asociados a melanoma en un sujeto.

17. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 12, para usar en un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria de CD8+ contra antígenos asociados a melanoma en un sujeto.

18. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, para usar en un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria de CD8+ contra antígenos asociados a melanoma en un sujeto.

19. Un medicamento que comprende una composición de sensibilización y una composición de refuerzo para usar en un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo, comprendiendo dicha composición de sensibilización una construcción de poliepítopos que codifica o comprende una pluralidad de epítopos; comprendiendo dicha composición de refuerzo una pluralidad de construcciones individuales, cada una comprendiendo uno de dicha pluralidad de epítopos; en el que la construcción de poliepítopos se muestra en la SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2.

20. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicha construcción de poliepítopos de sensibilización es una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2.

21. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicha composición de refuerzo comprende construcciones de ácidos nucleicos individuales, cada una codificando uno de la pluralidad de epítopos.

22. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la composición de sensibilización comprende uno o más vehículos que llevan la construcción de poliepítopos.

23. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la composición de refuerzo comprende uno o más vehículos que llevan las construcciones de ácidos nucleicos.

24. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 22 o reivindicación 23, en el que el vehículo es un vector de expresión de ácido nucleico.

25. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el vector de expresión del ácido nucleico es un vector vírico.

26. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que el vector vírico se selecciona del grupo que consiste en vector adenovírico, vector del virus Herpes simple, vector del virus vaccinia, vector del virus de la viruela aviar y vector de alfavirus.

27. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho vector alfavirus es el vector del virus del bosque de Semliki.

28. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la construcción de poliepítopos de sensibilización es un péptido, polipéptido o proteína que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2.

29. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que las construcciones de refuerzo son péptidos, polipéptidos o proteínas individuales, cada una comprendiendo uno de dicha pluralidad de epítopos.

30. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 28, en el que dicha composición de sensibilización comprende además uno o más vehículos que llevan la construcción de poliepítopos.

31. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 29, en el que dicha composición de refuerzo comprende además uno o más vehículos que llevan las construcciones individuales.

32. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 30 o reivindicación 31, en el que el vehículo es una célula.

33. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 32, en el que la célula es una célula presentadora de antígeno.

34. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 33, en el que la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica o un linfocito.

35. Un medicamento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 34, en el que la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD8+ .

36. Una célula que comprende una secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1.

37. Una célula de acuerdo con la reivindicación 36, en la que dicha célula es una célula presentadora de antígeno.

38. Una célula de acuerdo con la reivindicación 37, en la que dicha célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica, un linfocito o una célula tumoral.