Materiales y métodos para aumentar la internalización celular.

Una composición para administrar hormona de liberación de gonadotropina (GnRH) o un análogo de GnRHintracelularmente a una célula,

comprendiendo:

un hidrogel biocompatible, y

GnRH o un análogo de GnRH;

caracterizado porque la composición tiene una viscosidad aparente de entre 10 y 200 Poise (entre 1 y 20 N.m-2.s)cuando se mide usando un reómetro de tensión controlada a 37°C usando una geometria de platina cónica en unintervalo de tensión aplicada de entre 1 y 100 Pascales.

Campo de la Invención [0001] Las composiciones y métodos de uso aquí descritos están en el área de materiales y métodos para aumentar la penetración celular.

Antecedentes de la Invención [0002] Es a menudo difícil administrar compuestos tales como proteínas, péptidos, material genético, y otros medicamentos y compuestos diagnósticos intracelularmente porque las membranas celulares a menudo resisten el paso de estos compuestos. Varios métodos han sido desarrollados para administrar agentes intracelularmente. Por ejemplo, ha sido administrado material genético dentro de células in vivo, vitro y ex vivo usando vectores virales, ADN/complejos lípidos y liposomas. Mientras que los vectores virales son eficientes, permanecen interrogantes en referencia a la seguridad de un vector vivo y al desarrollo de una respuesta inmune después de administración repetida. Los complejos lípidos y liposomas resultan menos efectivos al transfectar ADN dentro del núcleo de la célula y pueden ser potencialmente destruidos por macrófagos in vivo.

Las proteínas y los péptidos son tipicamente administrados por administración parenteral, o, en algunos casos, en la membrana mucosa nasal. La absorción de los medicamentos administrados tópicamente es frecuentemente pobre, y la degradación ocurre con frecuencia cuando los medicamentos son administrados oralmente. Por ejemplo, hormonas tales como la hormona de liberación de la gonadotropina ("GnRH") y sus análogos han sido administrados a humanos en un intento de incrementar la fertilidad incrementando los niveles sistémicos de la hormona luteinizante ("LH") . Cuando dada a menudo, se ha mostrado que pequeñas dosis de GnRH nativa inducen el desarrollo folicular y la ovulación. Estos medicamentos son típicamente administrados por medio de un catéter permanente dentro de la cavidad abdominal. Se adjunta al catéter una bomba externa que inyecta el péptido a intervalos frecuentes. Este método de administración es extremadamente invasivo e indeseado. También, el método es prohibitivamente caro para el uso en animales.

La unión de ligandos o proteínas de ensamblaje a los receptores de superficie de las membranas de células eucarióticas ha sido extensamente estudiada en un esfuerzo de desarrollar mejores modos de promover o aumentar la absorción celular. Por ejemplo, se ha informado que la unión de ligandos o proteínas inicia o acompaña una cascada de fenómenos sin equilibrio culminando en la invaginación celular de complejos de membrana dentro de vesículas recubiertas por aparente [Goldstein, J.L., et al. (1983) Ann. Rev. Cell Biol. 1, 1-39; Rodman, T.S., et al. (1990) Curr. Op. Cell Biol. 2, 664-672; Trowbridge, I.S. (1991) Curr. Op. Cell Biol. 3, 634-641; Smythe, E., et al. (1989) J. Cell Biol. 108, 843-853; Smythe, E., et al. (1992) J. Cell Biol. 119, 1163-1171; and Schmid, S.L. (1993) Curr. Op. Cell Biol. 5, 621-627]. Se hace referencia a este proceso ciado como endocitosis mediada por receptor (RME) . Más allá de jugar un papel central en el tráfico del lípido celular [Pagano, R.E. (1990) Curr. Op. Cell Biol. 2, 652-663], RME es el medio principal por el cual las macromoléculas entran en las células eucarióticis. Tener un mejor entendimiento del papel del RME en la absorción de los medicamentos sería ventajoso para desarrollar métodos mejorados de administración de medicamentos.

Sería ventajoso tener nuevos métodos para administrar un GnRH y sus análogos intracelularmente. Es por tanto un objeto de la presente invención proporcionar composiciones y métodos para aumentar la administración intracelular de GnRH y sus análogos.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar métodos menos invasivos de administración.

Resumen de la Invención [0007] Se revelan composiciones y métodos para aumentar la penetración celular de GnRH y sus análogos. Las composiciones incluyen un compuesto para ser administrado y un hidrogel viscoso biocompatible. Controlando la viscosidad aparente del material viscoso se aumentan las velocidades de endocitosis ("RME") , incluyendo la “pinocitosis” inespecífica y la endocitosis específica mediada por receptor (“RME”) . La velocidad de penetración endocítica aumenta cuando el cociente de las viscosidades aparentes del medio citosólico y extracelular se apróxima a la unidad. Esto lleva a altas velocidades de transporte de los compuestos a ser administrados por las membranas celulares, facilitando una administración más eficiente de los medicamentos y agentes diagnósticos.

La viscosidad aparente de la composición es controlada de tal modo que se mantiene en el intervalo de entre 10 y 200 Poise, por ejemplo entre 50 y 200 Poise (1 poise = 0.1 N n-2 s) .

Las composiciones se aplican a las membranas celulares para alcanzar velocidades elevadas de transporte de medicamentos por esas membranas, respecto a cuando se usan fluidos no viscosos. Los métodos para administrar las composiciones incluyen la aplicación de forma tópica o por inyección. Las composiciones pueden ser aplicadas por vía oral, nasal, vaginal, rectal y ocular. Las composiciones pueden ser aplicadas por inyección por medio de un catéter, intramuscularmente, subcutáneamente, o intraperitonealmente. Las composiciones pueden ser también administradas al sistema pulmonar o respiratorio, más preferiblemente en un aerosol.

Los ejemplos demuestran la administración de transferrina a celulas individuales para aumentar el indice de absorción de transferrina y la administración intravaginal de leuprolida para incrementar los niveles de LH en ovejas. La transferrina es un polipéptido modelo. Las composiciones conteniendo transferrina no son realizaciones en sí mismas de la invención reivindicada.

Descripción de los Dibujos [0011]

La Figura 1 muestra la viscosidad aparente respecto al esfuerzo cortante aplicado para varias soluciones de methocel (0, 1, 1.25, 1.5, 1.7, y 1.8%) . Se muestra un valor característico de la viscosidad celular. Las lineas discontinuas verticales estiman los valores de la máxima y mínima fuerza administrada por una célula sobre el fluido extracelular por conductos invaginantes.

La Figura 2 muestra valores en régimen permanente de 125I-Tf internalizado total respecto a 125I-Tf total asociado a superficie (In/Sur) para células K562 suspendidas en soluciones de methocel de concentraciones de methocel variables entre 0 y 2%. Las barras de error representan el error medio estándar, con n=4.

La Figura 3 muestra valores en régimen permanente de 125I-Tf internalizado total respecto a 125I-Tf total asociado a superficie (In/Sur) para células CHO suspendidas (línea superior con bloques abiertos) y adherida (línea inferior con bloques cerrados) en soluciones de methocel en concentraciones de methocel variables. Las barras de error representan el error estándar medio, con n=4.

La Figura 4 muestra la concentración sistémica de LH después de la administración intravaginal a ovejas de leuprolida en soluciones de methocel al 1.5% y 1.75 % .

La Figura 5 muestra la biodisponibilidad absoluta de la leuprolida (biodisponibilidad en porcentaje) de sistemas de administración de hidrogel optimizadoreológicamente (methocel al 1.5 y 1.75 % ) comparada con un sistema de administración de hidrogel de control.

La Figura 6 muestra la concentración sistémica de LH después de la administración nasal de 100 μg de acetato de leuprolida en methocel 1.5% y methocel 0.0% ( control solución salina) a ovejas.

La Figura 7 muestra la concentración sistémica de cortisol (ng/mL) después de administración intravenosa e intravaginal de vasopresina a ovejas. Los circulos oscurecidos representan administración IV (10 microgramos de vasopresina) sin un vehículo viscoso. Los círculos vacios representan el control, sin gel viscoso o vasopresina. Los triángulos oscurecidos representan la administración intravaginal de 200 Ig de vasopresina en 1.5 % de methocel. Los triángulos vacios representan la administración intravaginal de 200 μg de vasopresina en methocel 1.75 % .

Descripción Detallada de la Invención

Se describen composiciones y métodos para la absorción mejorada de una administración intracelular de compuestos en una solución viscosa. La penetración celular es mejorada incrementando la velocidad de endocitosis, particularmente la endocitosis mediada por receptor, controlando la viscosidad de la solución. Las composiciones incluyen GnRH o un análogo de la misma y un fluido con una viscosidad aparente del fluido citoslico en la célula a la que se administra la composición.

GnRH y sus análogos interactúan con los receptores sobre la superficie de la célula a la cual tiene que ser administrada.... [Seguir leyendo]

1. Una composición para administrar hormona de liberación de gonadotropina (GnRH) o un análogo de GnRH intracelularmente a una célula, comprendiendo:

un hidrogel biocompatible, y

GnRH o un análogo de GnRH;

caracterizado porque la composición tiene una viscosidad aparente de entre 10 y 200 Poise (entre 1 y 20 N.m-2.s) cuando se mide usando un reómetro de tensión controlada a 37°C usando una geometria de platina cónica en un intervalo de tensión aplicada de entre 1 y 100 Pascales.

2. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 1 en la que la célula es una célula eucariótica.

3. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 2 en la que la célula es una célula mamífera, preferiblemente una humana.

4. Una composición de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-3 en la que la célula es una célula de la vagina, recto, nariz, oíido, boca, pulmones, o piel.

5. La composición de la Reivindicación 1 en la que la viscosidad aparente de la composición está entre 50 y 200 Poise (entre 5 y 20 N.m-2.s) .

6. La composición de la Reivindicación 1 en la que el hidrogel comprende una celulosa, polioxialquileno, polivinilipirrolidona, dextrano, alginato, agarosa, gelatina, ácido hialurónico, trehalosa, alcohol polivinílico, copolímeros y mezclas de los mismos, poliacrilamida, polifosfacina, poliacrilato, o copolímero bloque de polioxialquileno.

7. La composición de la Reivindicación 1 en la que el hidrogel comprende un polisacárido, una proteína o un polímero sintético.

8. La composición de la Reivindicación 7 en la que el polisacárido es una celulosa, un dextrano o un alginato.

9. La composición de la Reivindicación 8 en la que la celulosa es metilcelulosa.

10. La composición de la Reivindicación 9 comprendiendo metilcelulosa en una concentración de 1.25 a 1.8% (p/p) .

11. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1-10 for use in medicine.

12. Uso de la composición de cualquiera de s Reivindicaciones 1-10 en la preparación de un medicamento para suministrar agentes a células.

13. El uso de la Reivindicación 12 en el que la célula a la que el agente tiene que ser suministrado está en la nariz, vagina, recto, ojo, oído, boca, pulmones, o piel.

14. Un método para suministrar GnRH o un análogo de GnRH a células in vitro comprendiendo administrar a las células una composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1-10.

15. Una composición como se reivindica en cualquiera de la Reivindicaciones 1 a 10 comprendiendo ademas un agente biocompatible activo de superficie.