Métodos de marcaje de materiales.

Un método para detectar si uno de una pluralidad de materiales ha sido marcado con un marcador que comprende una etiqueta de ácido nucleico en donde la secuencia de la etiqueta nucleica es específica para este material,

comprendiendo este método los pasos de: (a) tomar una muestra de una porción del material; y (b) detectar la presencia de la etiqueta de ácido nucleico en la muestra, estando dicho método caracterizado en el hecho de que la cantidad de etiqueta de ácido nucleico presente en la muestra se determina para proporcionar una indicación de la cantidad de marcador presente en el material.

Métodos de marcaje de materiales.

La presente invención se refiere a métodos para marcar materiales y a la detección de dicho marcado.

Existe una necesidad generalizada de poder trazar el recorrido que ha realizado un material determinado a medida que se traslada de un lugar a otro. El movimiento puede ser de materiales naturales (por ejemplo, el flujo de agua en acuíferos subterráneos) o materiales que han sido procesados o fabricados por el hombre (por ejemplo, cualquier artículo construido por el hombre en un proceso de fabricación o recursos naturales tales como granos y minerales) . En tales situaciones existen motivos por los que es necesario desarrollar procedimientos específicos para trazar dichos movimientos. Puede suceder que la observación directa no sea posible, como al seguir el recorrido de un flujo subterráneo. Puede suceder que sea necesario supervisar el movimiento de artículos sin el conocimiento directo de los transportadores o, por motivos legales, para demostrar que el aspecto de un material en un punto determinado de la biosfera se debió al propio material originado en un punto de partida conocido.

Por ejemplo, puede ocurrir que artículos fabricados sean robados durante el tránsito o revendidos a un precio muy inferior al determinado por el proveedor por un distribuidor poco escrupuloso, por ejemplo en venta callejera. Un problema clave a la hora de condenar este hecho es la identificación de los artículos determinados vendidos, para establecer que dichos artículos han sido robados o revendidos por un distribuidor determinado. También se producen problemas con líquidos tales como el petróleo que los buques eliminan de forma rutinaria en el mar. Es casi imposible identificar qué buque ha descargado el combustible y por ese motivo son infrecuentes los procesos judiciales y condenas por contaminar los océanos. Hay otros problemas asociados con el movimiento de materiales naturales, por ejemplo el movimiento de grano. Es especialmente difícil distinguir un lote de dichos materiales naturales de otros. En el caso del grano, en la Comunidad Europea se producen problemas con los granos que se transportan a través de diferentes fronteras para obtener una serie de subsidios de la UE por el mismo lote de grano. Es necesario contar con un método para marcar el grano y que este resulte fácilmente detectable para evitar dicho fraude.

Se conocen diversos métodos en la técnica para marcar y detectar materiales, muchos de los cuales utilizan etiquetas de ácido nucleico de microtrazado, especialmente etiquetas fabricadas a partir de ADN. Los ácidos nucleicos pueden proporcionar una cantidad ilimitada de información, debido a la secuencia variable de bases (adenina, citosina, guanina y timina [uracil en el caso de ARN que sustituye a la timina]) contenidas en la molécula. Pueden calcularse las condiciones de probabilidad de la frecuencia de una secuencia de bases determinada y, siempre que se utilicen bases suficientes, es decir, que se emplee como etiqueta una molécula de ADN lo suficientemente larga, puede definirse un microtrazado exclusivo con propósitos prácticos. Al usar combinaciones de secuencias universales (aceptadas como estándares de la industria) y al variar los niveles de secuencias específicas, es posible identificar el tipo de producto genérico, el origen del producto (secuencias específicas de la empresa) , el lote e incluso proporcionar un identificador para una unidad de comercio.

La solicitud de patente internacional anterior núm. PCT/GB91/00719 (publicada como WO91/17265) se describe un método para supervisar el movimiento de un hidrocarburo mediante la adición de ADN compatible con hidrocarburo como un aditivo de microtrazado. La solicitud internacional núm. PCT/GB93/01822 (publicada como WO94/04918) describe un método para marcar un líquido y posteriormente detectar que el líquido ha sido marcado que comprende añadir un aditivo al líquido. El aditivo comprende dos o más tipos de partículas no visibles a simple vista, cada una con diferentes medios de señalización o partículas con dos o más medios de señalización diferentes. Los medios de señalización ayudan en la detección de las microperlas. Uno de los medios de señalización comprende ácido nucleico, mientras que el otro no es una etiqueta de ácido nucleico. En cada uno de los métodos citados, se añade el microtrazado exclusivo que comprende moléculas de ADN al material, se toman muestras del material resultante tras su movimiento, y se detecta, analiza y descodifica la presencia del aditivo de microtrazado en la muestra.

La solicitud internacional núm. PCT/GB94/01506 (publicada como WO95/02702) describe un método para marcar un artículo sólido o elemento añadiendo a un líquido un aditivo que comprende microperlas no visibles a simple vista que comprende dos o más medios de señalización para ayudar en su detección y medios de codificación para ayudar en su identificación. El aditivo puede comprender dos o más microperlas cada una con diferentes medios de señalización, teniendo al menos una microesfera un medio de codificación, o bien puede comprender una microesfera con dos o más medios de señalización diferentes y al menos un medio de codificación. El medio de codificación y uno de los medios de señalización comprenden un ácido nucleico y otro de dichos medios de señalización comprende un medio de señalización de ácido no nucleico. El líquido que contiene el aditivo se añade al sólido y se deja secar para marcar el sólido. Posteriormente, se detectan microperlas con medios de señalización en el sólido, se toman muestras del sólido y se descodifica el medio de codificación. El método puede adaptarse para su uso en la supervisión e interacción entre cualquier material, artículo, o elemento, y una persona o animal, utilizando un dispositivo adaptado para producir un aerosol que contiene un líquido que comprende un aditivo que contiene una pluralidad de microperlas.

La solicitud internacional núm. PCT/GB93/01822 (publicada como WO94/04918) describe un método para marcar un líquido y posteriormente detectar que el líquido ha sido marcado. El método comprende: añadir al líquido un aditivo que comprende una pluralidad de partículas en una cantidad no superior a 1 parte en peso de partículas por 10⁶ partes en peso de líquido, comprendiendo las partículas medios de señalización para ayudar en su detección y no siendo estos detectables a simple vista en el líquido; tomar una muestra de una posición del líquido que contiene el aditivo, y detectar la presencia de partículas en el líquido, con la condición de que los medios de señalización no estén formados únicamente por una etiqueta de ácido nucleico.

En cada uno de los métodos de la técnica anterior citados, el ácido nucleico o ADN de microtrazado descrito es un ácido nucleico o ADN sintético con una región variable flanqueada por regiones con secuencias predeterminadas. La secuencia de la región variable da a cada molécula de ácido nucleico o ADN de microtrazado una identidad característica única, mientras que las secuencias predeterminadas son comunes a todas las etiquetas. Las secuencias predeterminadas se reconocen mediante cebadores para su amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se usan para la posterior secuenciación. Así, para determinar la identidad de la región variable en el ácido nucleico o ADN de microtrazado, la región variable se amplifica usando cebadores complementarios a las regiones flanqueantes con secuencias predeterminadas. A continuación, se secuencia la región variable usando los mismos cebadores, para determinar la secuencia de la región variable y así la identidad de la etiqueta. Alternativamente, la secuenciación puede iniciarse a partir de una región de secuenciación del cebador incorporada a la etiqueta entre una región flanqueante y la región variable. Puesto que la región de secuenciación del cebador puede tener una secuencia exclusiva para una etiqueta determinada, esto permite la utilización de dos o más etiquetas diferentes de ácido nucleico o ADN para marcar el material.

A pesar de que los procedimientos descritos anteriormente son efectivos, los métodos de la técnica anterior proporcionan tan solo una respuesta de SÍ/NO. Es decir, pueden determinar si una muestra determinada contiene una etiqueta de ácido nucleico, y cuál es la identidad de la etiqueta. Sin embargo, en la medida que sabemos, nadie ha considerado previamente que puede ser deseable determinar la cantidad de etiqueta presente en un material marcado. Los métodos descritos en la técnica anterior se preocupan únicamente del marcado, detección e identificación de etiquetas, sin proporcionar ninguna indicación de...

1. Un método para detectar si uno de una pluralidad de materiales ha sido marcado con un marcador que comprende una etiqueta de ácido nucleico en donde la secuencia de la etiqueta nucleica es específica para este material, comprendiendo este método los pasos de:

(a) tomar una muestra de una porción del material; y

(b) detectar la presencia de la etiqueta de ácido nucleico en la muestra,

estando dicho método caracterizado en el hecho de que la cantidad de etiqueta de ácido nucleico presente en la muestra se determina para proporcionar una indicación de la cantidad de marcador presente en el material.

2. Un método según se reivindica en la Reivindicación 1 que adicionalmente comprende antes del paso (a) el paso de:

(i) añadir o aplicar un marcador que comprende una etiqueta de ácido nucleico al material.

3. Un método según se reivindica en la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, que comprende además el paso de amplificar al menos una porción de la etiqueta de ácido nucleico mediante una reacción de amplificación de ácido nucleico, determinándose la cantidad de amplificación necesaria para que la cantidad de etiqueta de ácido nucleico amplificado alcance un nivel predeterminado como una indicación de la cantidad de etiqueta de ácido nucleico presente en la muestra.

4. Un método según se reivindica en la Reivindicación 1, en donde la etiqueta de ácido nucleico comprende al menos una secuencia de identificación para la etiqueta, comprendiendo adicionalmente este método los pasos de:

(c) amplificar al menos una porción de la etiqueta de ácido nucleico mediante una reacción de amplificación de ácido nucleico que incluye poner en contacto la etiqueta de ácido nucleico con un primer oligonucleótido cebador que posee una secuencia que corresponde con la secuencia de identificación de la etiqueta de ácido nucleico; y

(d) determinar la cantidad de amplificación necesaria para que la etiqueta de ácido nucleico amplificada alcance un nivel predeterminado como indicación de la cantidad de marcador presente en la muestra.

5. Un método según se reivindica en la Reivindicación 1 en donde la etiqueta de ácido nucleico comprende una primera y una segunda región que flanquean una secuencia de identificación de la etiqueta; el paso (b) comprende adi- cionalmente separar la etiqueta de ácido nucleico de la muestra; este método comprende adicionalmente los pasos de:

(c) amplificar al menos una porción de la etiqueta de ácido nucleico mediante una reacción de amplificación de ácido nucleico que incluye poner en contacto la etiqueta de ácido nucleico con un primer oligonucleótido cebador que posee una secuencia que corresponde con dicha primera región de la etiqueta de ácido nucleico; y

(d) determinar la cantidad de amplificación necesaria para que la etiqueta de ácido nucleico amplificada alcance un nivel predeterminado como indicación de la cantidad de marcador presente en la muestra.

6. Un método según se reivindica en la Reivindicación 2 en donde la etiqueta de ácido nucleico comprende una primera y una segunda región que flanquean una secuencia de identificación para la etiqueta, y en donde el paso (b) comprende adicionalmente el paso de:

(c) poner en contacto la etiqueta de ácido nucleico con un primer oligonucleótido cebador cuya secuencia corresponde a una secuencia contenida en dicha primera región de la etiqueta de ácido nucleico y una sonda oligonucleótida que lleva un medio de señalización y cuya secuencia corresponde a dicha secuencia de identificación;

(d) amplificar al menos una porción de la etiqueta de ácido nucleico mediante una reacción en cadena de la polimerasa que incluye una polimerasa de ácido nucleico con una actividad exonucleasa de 5' a 3' en donde se liberan fragmentos que incluyen medios de señalización de la sonda oligonucleótida durante la amplificación del ácido nucleico; y

(e) detectar fragmentos liberados como indicación de que se ha producido la amplificación y por lo tanto que el material ha sido marcado.

7. Un método según se reivindica en la Reivindicación 2, en donde la etiqueta de ácido nucleico comprende al menos una secuencia de identificación para la etiqueta, cuyo método comprende adicionalmente los pasos de:

(c) amplificar al menos una porción de la etiqueta de ácido nucleico mediante una reacción de amplificación de ácido nucleico que incluye poner en contacto la etiqueta de ácido nucleico con un primer oligonucleótido con una secuencia que corresponde con la secuencia de identificación de la etiqueta de ácido nucleico; y

(d) determinar la cantidad de amplificación necesaria para que la etiqueta de ácido nucleico amplificada alcance un nivel predeterminado como indicación de la cantidad de marcador presente en la muestra y así la cantidad de marcador en el material.

8. Un método según se reivindica en la Reivindicación 2, en donde el paso (i) comprende los pasos de:

(ii) proporcionar un grupo de etiquetas de ácido nucleico, cada una de las cuales comprende una región genérica con una secuencia presente en todas las etiquetas de ácido nucleico dentro del grupo, estando la región genérica flanqueada por regiones codificadas con secuencias de identificación para la etiqueta;

(iii) seleccionar una etiqueta de ácido nucleico determinada dentro del grupo; y

(iv) añadir o aplicar un marcador que comprende la etiqueta seleccionada de ácido nucleico al material.

9. Un método según se reivindica en la Reivindicación 1, en donde la etiqueta de ácido nucleico procede de un grupo conocido de diferentes etiquetas de ácido nucleico, comprendiendo cada etiqueta de ácido nucleico del grupo al menos una secuencia de identificación para la etiqueta, en donde el paso (b) comprende los pasos de:

(c) formar una pluralidad de medios de reacción de amplificación de ácido nucleico, conteniendo cada medio un oligonucleótido con una secuencia que corresponde a la secuencia de identificación de una etiqueta de ácido nucleico conocida diferente del grupo y que puede amplificar una etiqueta de ácido nucleico diferente del grupo;

(d) poner en contacto la etiqueta de ácido nucleico con cada uno de dichos medios de reacción; y

(e) detectar cuál de los medios de reacción tiene como resultado la amplificación de la etiqueta de ácido nucleico como una indicación de la identidad de la etiqueta de ácido nucleico particular usada para marcar el material.

10. Un método según se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 3, 4 o 7, en donde la reacción de amplificación del ácido nucleico es una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .

11. Un método según se reivindica en la Reivindicación 10, condicionado por la Reivindicación 3, en donde la etiqueta de ácido nucleico se pone en contacto con un primer oligonucleótido cebador con una secuencia que se corresponde a una primera secuencia contenida en la etiqueta de ácido nucleico y capaz de cebar la amplificación de la etiqueta de ácido nucleico.

12. Un método según se reivindica en la Reivindicación 11, en donde la primera secuencia es una secuencia de identificación para la etiqueta de ácido nucleico.

13. Un método según se reivindica en la Reivindicación 10, condicionado por las Reivindicaciones 4 o 7 o según se reivindica en las reivindicaciones 11 o 12, en donde la etiqueta de ácido nucleico se pone en contacto con una sonda oligonucleótida con un medio de señalización y con una secuencia que corresponde a una segunda secuencia contenida en la etiqueta de ácido nucleico, incluyendo la reacción PCR una polimerasa de ácido nucleico con actividad exonucleasa 5' a 3' para provocar la liberación de fragmentos que llevan medio de señalización de la sonda oligonucleótida durante la amplificación de ácido nucleico.

14. Un método según se reivindica en la Reivindicación 12, en donde la etiqueta de ácido nucleico comprende además una segunda secuencia de identificación, entrando en contacto la etiqueta de ácido nucleico con un segundo oligonucleótido cebador capaz de cebar la amplificación de la etiqueta y con una secuencia que corresponde a la segunda secuencia de identificación.

15. Un método según se reivindica en la Reivindicación 13 condicionado por la Reivindicación 11, en donde la segunda secuencia es una secuencia de identificación para la etiqueta de ácido nucleico.

16. Un método según se reivindica en la Reivindicación 13, en donde la etiqueta de ácido nucleico comprende además una segunda secuencia de identificación para la etiqueta de ácido nucleico, flanqueando la primera y la segunda secuencia de identificación dicha segunda secuencia.

17. Un método según se reivindica en la Reivindicación 16, en donde la etiqueta de ácido nucleico se pone en contacto con un segundo oligonucleótido cebador capaz de cebar la amplificación de la etiqueta y que tiene una secuencia que corresponde a dicha secuencia de identificación.

18. Un método según se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 4, 7 o de 10 a 15 en donde la cantidad de ácido nucleico amplificado en la reacción de amplificación se determina midiendo el material de ácido nucleico que puede hibridarse en una sonda de ácido nucleico, teniendo la sonda de ácido nucleico una secuencia que corresponde a una secuencia contenida en la etiqueta de ácido nucleico, no solapándose dicha secuencia con una secuencia usada para cebar la amplificación de ácido nucleico.

19. Un método según se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 4, 5, 7, 13, 16 o 17, en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico es una reacción en cadena de la polimerasa, siendo el primer oligonucleótido capaz de cebar la amplificación de la etiqueta de ácido nucleico.

20. Un método según se reivindica en la Reivindicación 2 en donde la etiqueta de ácido nucleico comprende una primera y una segunda región que flanquean una secuencia de identificación de la etiqueta; el paso (b) comprende adicionalmente separar la etiqueta de ácido nucleico de la muestra; este método comprende adicionalmente los pasos de:

(c) amplificar al menos una porción de la etiqueta de ácido nucleico mediante una reacción en cadena de la polimerasa que incluye poner en contacto la etiqueta de ácido nucleico con un primer oligonucleótido cebador cuya secuencia corresponde a dicha primera región de la etiqueta de ácido nucleico, siendo este primer oligonucleótido cebador capaz de amplificar el cebado de la etiqueta de ácido nucleico, y

(d) determinar la cantidad de amplificación necesaria para que la etiqueta de ácido nucleico amplificada alcance un nivel predeterminado como indicación de la cantidad de marcador presente en la muestra,

y en donde la etiqueta de ácido nucleico se pone en contacto con una sonda oligonucleótida con un medio de señalización y posee una secuencia que corresponde a dicha secuencia de identificación, incluyendo la reacción PCR una polimerasa de ácido nucleico con actividad exonucleasa 5' a 3' para provocar la liberación de fragmentos que llevan medio de señalización de la sonda oligonucleótida durante la amplificación de ácido nucleico.

21. Un método según se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 5, 11, 12, 14 o 19, en donde el primer oligonucleótido cebador lleva un medio de señalización, una señal de un primer oligonucleótido cebador incorporado en un ácido nucleico amplificado que se mide para proporcionar una indicación de la cantidad de ácido nucleico amplificado en la reacción.

22. Un método según se reivindica en la Reivindicación 19 condicionado por la Reivindicación 4, en donde el primer oligonucleótido cebador lleva un medio de señalización, una señal de un primer oligonucleótido cebador incorporado en un ácido nucleico amplificado que se detecta para proporcionar una indicación de que se ha producido la amplificación.

23. Un método según se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 21 o 22, en donde una señal detectable de un primer oligonucleótido cebador incorporado en un ácido nucleico amplificado se encuentra en un nivel más elevado que una señal detectable del primer oligonucleótido cebador cuando no está incorporado.

24. Un método según se reivindica en la Reivindicación 23, en donde el primer oligonucleótido cebador lleva medios de atenuación, para atenuar una señal del medio de señalización cuando no está incorporado el primer oligonucleótido cebador.

25. Un método según se reivindica en la Reivindicación 23, en donde el primer oligonucleótido cebador lleva medios de atenuación, para atenuar una señal del medio de señalización llevado por el primer oligonucleótido cebador.

26. Un método según se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 6, 19 o 20, en donde la etiqueta de ácido nucleico se pone en contacto con un segundo oligonucleótido cebador capaz de amplificar el cebado de la etiqueta y con una secuencia que corresponde a una secuencia contenida en la segunda región.

27. Un método según se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 13, 15 a 17 o 20 o la Reivindicación 26 condicionado por la Reivindicación 20, en donde una señal de un medio de señalización llevada en los fragmentos liberados se mide para proporcionar una indicación de la cantidad de ácido nucleico amplificado en la reacción.

28. Un método según se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 13, 15 a 17, 26 o 27, en donde una señal detectable de un fragmento liberado tiene un nivel más elevado que una señal detectable de una sonda oligonucleótida.

29. Un método según se reivindica en la Reivindicación 28, en donde la sonda oligonucleótida lleva medio de atenuación para atenuar una señal del medio de señalización de la sonda oligonucleótida.

30. Un método según se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 6, 13, 15 a 17, 20 a 25 o 26 a 29, en donde el medio de señalización es una etiqueta fluorescente.

31. Un método según se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 24, 25, 28 o la Reivindicación 30 condicionado por la Reivindicación 29, en donde medio de atenuación para atenuar una señal del medio de señalización mediante la transferencia de energía de resonancia a través del espacio de Förster.

32. Un método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el marcador comprende además un medio indicador, la presencia de dicho indicador significa que es detectable en una porción de muestra del material como una indicación de que la etiqueta de ácido nucleico está presente en dicha porción de muestra.

33. Un método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el paso de tomar una muestra de una porción del material marcado comprende además el paso de separar la etiqueta de ácido nucleico de la muestra.

34. Un método para marcar un material con una etiqueta de ácido nucleico, cuyo método comprende los pasos de:

(a) proporcionar un grupo de etiquetas de ácido nucleico, cada una de las cuales comprende una región genérica con una secuencia presente en todas las etiquetas de ácido nucleico dentro del grupo, estando la región genérica flanqueada por regiones codificadas con secuencias de identificación para la etiqueta;

(b) seleccionar una etiqueta de ácido nucleico determinada dentro del grupo; y

(c) añadir o aplicar un marcador que comprende la etiqueta seleccionada de ácido nucleico al material.

35. Un método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etiqueta de ácido nucleico se compone de ADN.

36. Un método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etiqueta de ácido nucleico es un oligonucleótido de ADN monocatenario.