Marcadores mitocondriales de enfermedades neurodegenerativas.

Marcadores mitocondriales de enfermedades neurodegenerativas.

La presente invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar o para determinar el riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto basado en la determinación del patrón de metilación en ciertas regiones del ADN mitocondrial de dicho sujeto o en la determinación del nucleótido en la posición polimórfica 16519 del ADN mitocondrial de dicho sujeto. Finalmente

, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos adecuados para poner en práctica la invención.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201430444.

Solicitante: INSTITUT D' INVESTIGACIÓ BIOMÈDICA DE BELLVITGE (IDIBELL).

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: BARRACHINA CASTILLO,MARTA, FERRER ABIZANDA,Isidre, BLANCH LOZANO,Marta.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

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Ilustración 1 de Marcadores mitocondriales de enfermedades neurodegenerativas.
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Marcadores mitocondriales de enfermedades neurodegenerativas.

Fragmento de la descripción:

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuadra dentro de los métodos de diagnóstico de enfermedades neurológicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Existe un número considerable de enfermedades neurodegenerativas que están causadas o están asociadas con alteraciones en la función mitocondrial. La enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP) se encuentran dentro de este grupo. Las características fisiopatológicas de la EA y de la EP están relacionadas con depósitos de proteínas agregadas. En concreto, la EA está asociada con la formación de agregados intracelulares de tau fosforilado en los ovillos neurofibrilares y agregados extracelulares del péptido p-amiloide en las placas seniles y la EP está asociada con la formación de agregados anormales de a-sinucleina que constituyen el componente principal de los llamadas cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy.

Es conocido que enfermos de Alzheimer muestran niveles reducidos de la subunidad ND4 en tejido cerebral y que enfermos de Parkinson muestran niveles reducidos de ND6 en la sustancia negra. Además, estudios genéticos han permitido identificar mutaciones en varios genes COX y en la región D-Loop así como deleciones en el ADNmt de cerebros de sujetos con EA y en la sustancia negra en sujetos con EP.

En la técnica se han desarrollado diferentes métodos y estrategias para el diagnóstico, la predicción del inicio y el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas y, en particular de EA y EP. Así, se han descrito métodos de diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas basados en la identificación de mutaciones en el ADN mitocondrial mediante la el empleo de la técnica RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción) o de otras técnicas relacionadas. El documento WO98038334 describe un método de diagnóstico de EA basado en la identificación de mutaciones en genes COX. También se ha propuesto un método de diagnóstico de la EP en un sujeto mediante la identificación de polimorfismos de nucleótido simple en muestras de ADN mitocondrial de un sujeto (WO 2000063441). Otros documentos del estado de la técnica describen métodos para el diagnóstico de Alzheimer o Parkinson basados en la identificación de polimorfismos en genes nucleares que codifican proteínas que controlan el proceso de transcripción mitocondrial.

A pesar de los esfuerzos hechos hasta la fecha, todavía existe la necesidad de disponer de métodos fiables para diagnosticar enfermedades neurodegenerativas tales como EA y EP, así como para diagnosticar del estadio de dichas enfermedades y pronosticar la evolución de las mismas.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para diagnosticar o para determinar el riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson en un sujeto que comprende determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patrón de metilación en la región D-loop y/o en el gen ND1, en donde el patrón de metilación se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:

(i) los sitios CpG de la región D-loop mostrados en la Tabla 1

(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2,

(iii) los sitios CHG de la región D-loop mostrados en la Tabla 3,

(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o

(v) los sitios CHH de la región D-loop mostrados en la Tabla 5,

en donde una hipermetilación en al menos uno de dichos sitios CpG de la región D-loop, una

hipermetilación en al menos uno de dichos sitios CHG de la región D-loop, una

hipermetilación en al menos uno de dichos sitios CHH de la región D-loop, una

hipometilación en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilación en

al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 es indicativo de que el sujeto sufre de la enfermedad de Alzheimer o de que el sujeto tiene un riego elevado de desarrollar la enfermedad de Alzheimer o

en donde una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CpG de la región D-loop, una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHG de la región D-loop y/o una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHH de la región D-loop es indicativo de que el sujeto sufre de la enfermedad de Parkinson o de que el sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar la enfermedad de Parkinson.

En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para seleccionar un sujeto para someterlo a un tratamiento preventivo de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson en un sujeto que comprende determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN mitocondrial, el patrón de metilación en la región D-loop y/o en el gen ND1, en donde el patrón de metilación se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:

(i) los sitios CpG de la región D-loop mostrados en la Tabla 1,

(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;

(iii) los sitios CHG de la región D-loop mostrados en la Tabla 3,

(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o

(v) los sitios CHH de la región D-loop mostrados en la Tabla 5

en donde una hipermetilación en al menos uno de dichos sitios CpG de la región D-loop, una

hipermetilación en al menos uno de dichos sitios CHG de la región D-loop, una

hipermetilación en al menos uno de dichos sitios CHH de la región D-loop, una

hipometilación en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilación en

al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Alzheimer o en donde una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CpG de la región D-loop, una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHG de la región D-loop y/o una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHH de la región D-loop es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Parkinson.

En un tercer aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para monitorizar la progresión de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson en un sujeto que comprende:

a) determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN mitocondrial el patrón de metilación en la región D-loop, y/o en el gen ND1, en donde el patrón de metilación se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:

(i) los sitios CpG de la región D-loop mostrados en la Tabla 1,

(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;

(iii) los sitios CHG de la región D-loop mostrados en la Tabla 3,

(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o

(v) los sitios CHH de la región D-loop mostrados en la Tabla 5

b) comparar el patrón de metilación determinado en la etapa a) con dicho patrón de metilación obtenido en un estadio anterior de la enfermedad,

en donde una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CpG de la región D-loop, una

hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHG de la región D-loop, una

hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHH de la región D-loop, una

hipometilación en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 con respecto dicho patrón de metilación determinado en un estadio anterior de la enfermedad, es indicativo del avance de la enfermedad de Alzheimer; y

... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método in vitro para diagnosticar o para determinar el riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson en un sujeto que comprende determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN mitocondrial el patrón de metilación en la región D-loop y/o en el gen ND1, en donde el patrón de metilación se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:

(i) los sitios CpG de la región D-loop mostrados en la Tabla 1,

(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;

(iii) los sitios CHG de la región D-loop mostrados en la Tabla 3,

(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o

(v) los sitios CHH de la región D-loop mostrados en la Tabla 5

en donde una hipermetilación en al menos uno de dichos sitios CpG de la región D-loop, una hipermetilación en al menos uno de dichos sitios CHG de la región D-loop, una hipermetilación en al menos uno de dichos sitios CHH de la región D-loop, una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 es indicativo de que el sujeto sufre de la enfermedad de Alzheimer o de que el sujeto tiene un riego elevado de desarrollar la enfermedad de Alzheimer o

en donde una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CpG de la región D-loop, una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHG de la región D-loop y/o una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHH de la región D-loop es indicativo de que el sujeto sufre de la enfermedad de Parkinson o de que el sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar la enfermedad de Parkinson.

2. El método según la reivindicación 1, en donde una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CpG de la región D-loop o una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHG de la región D-loop con respecto al patrón de metilación en un sujeto en estadio l-ll de la enfermedad de Alzheimer es indicativo de que el sujeto sufre de la enfermedad de Alzheimer en estadio lll-IV.

3. Método in vitro para seleccionar un sujeto para someterlo a un tratamiento preventivo de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer y la

enfermedad de Parkinson en un sujeto que comprende determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN mitocondrial el patrón de metilación en la región D-loop y/o en el gen ND1, en donde el patrón de metilación se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:

(i) los sitios CpG de la región D-loop mostrados en la Tabla 1,

(¡i) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;

(iii) los sitios CHG de la región D-loop mostrados en la Tabla 3,

(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o

(v) los sitios CHH de la región D-loop mostrados en la Tabla 5

en donde una hipermetilación en al menos uno de dichos sitios CpG de la región D-loop, una hipermetilación en al menos uno de dichos sitios CHG de la región D-loop, una hipermetilación en al menos uno de dichos sitios CHH de la región D-loop, una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Alzheimer o en donde una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CpG de la región D-loop, una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHG de la región D-loop y/o una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHH de la región D-loop es indicativo de que el sujeto es candidato a recibir un tratamiento dirigido a prevenir la enfermedad de Parkinson.

4. Método para monitorizar la progresión de una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson en un sujeto que comprende:

a) determinar en una muestra de dicho sujeto que comprende ADN mitocondrial el patrón de metilación en la región D-loop, y/o en el gen ND1, en donde el patrón de metilación se determina en al menos un sitio seleccionado del grupo formado por:

(i) los sitios CpG de la región D-loop mostrados en la Tabla 1,

(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;

(iii) los sitios CHG de la región D-loop mostrados en la Tabla 3,

(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o

(v) los sitios CHH de la región D-loop mostrados en la Tabla 5

b) comparar el patrón de metilación determinado en la etapa a) con dicho patrón de metilación obtenido en un estadio anterior de la enfermedad,

en donde una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CpG de la región D-loop, una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHG de la región D-loop, una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHH de la región D-loop, una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CpG del gen ND1 y/o una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHG en el gen ND1 con respecto dicho patrón de metilación determinado en un estadio anterior de la enfermedad, es indicativo del avance de la enfermedad de Alzheimer; y

en donde una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CpG de la región D-loop, una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHG de la región D-loop y/o una hipometilación en al menos uno de dichos sitios CHH de la región D-loop con respecto a dicho patrón de metilación determinado en un estadio anterior de la enfermedad es indicativo del avance de la enfermedad de Parkinson.

5. El método según las reivindicaciones 1 a 4 en donde la determinación del patrón de metilación comprende la determinación de la metilación de todos los sitios CpG de la región D-loop mostrados en la Tabla 1.

6. El método según las reivindicaciones 1 a 5, en donde la determinación del patrón de metilación comprende la determinación de la metilación todos los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2.

7. El método según las reivindicaciones 1 a 6 en donde la determinación del patrón de metilación comprende la determinación de la metilación de todos los sitios CHG de la región D-loop mostrados en la Tabla 3.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde la determinación del patrón de metilación comprende la determinación del patrón de metilación de todos los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4.

9. El método según las reivindicaciones 1 a 8 en donde en donde la determinación del patrón de metilación comprende la determinación de la metilación de todos los sitios CHH de la región D-loop mostrados en la Tabla 5.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el patrón de metilación se determina por una técnica seleccionada del grupo que consiste en PCR específica de

metilación, secuenciación por bisulfito, técnicas basadas en restricción-digestión, pirosecuenciación, ensayo de ChIP-on chip, conversión diferencial, restricción diferencial y peso diferencial de los sitio(s) metilados.

11. Método según la reivindicación 10, en donde el patrón de metilación se determina mediante pirosecuenciación.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde la muestra que comprende ADN mitocondrial se selecciona de un biofluido o una biopsia de un tejido sólido.

13. Método según la reivindicación 12, en donde dicho biofluido se selecciona de sangre periférica o líquido cefalorraquídeo.

14. Método según la reivindicación 13, en donde dicho tejido sólido es tejido cerebral.

15. Un ácido nucleico seleccionado del grupo formado por:

(i) un ácido nucleico que comprende al menos 9 nucleótidos contiguos de una región del ADN mitocondrial en donde dicha región comprende al menos un sitio de metilación seleccionado del grupo formado por:

a) los sitios CpG de la región D-loop mostrados en la Tabla 1,

b) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;

c) los sitios CHG de la región D-loop mostrados en la Tabla 3,

d) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y

e) los sitios CHH de la región D-loop mostrados en la Tabla 5,

(¡i) un ácido nucleico que comprende al menos 9 nucleótidos contiguos de una región de ADN mitocondrial en donde dicha región comprende al menos un sitio de metilación seleccionado del grupo formado por:

a) los sitios CpG de la región D-loop mostrados en la Tabla 1,

b) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;

c) los sitios CHG de la región D-loop mostrados en la Tabla 3,

d) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y

e) los sitios CHH de la región D-loop mostrados en la Tabla 5.

en donde la posición correspondiente a la citosina en el sitio CpG, CHG o CHH es uracilo; y

(iii) un polinucleótido que híbrida de forma específica con los ácidos nucleicos de (i) o (ii).

16. Un kit que comprende al menos un oligonucleótido capaz de hibridar específicamente y de forma dependiente de metilación con una secuencia en el ADN mitocondrial que comprende un sitio de metilación seleccionado del grupo formado por:

(i) los sitios CpG de la región D-loop mostrados en la Tabla 1,

(¡i) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;

(iii) los sitios CHG de la región D-loop mostrados en la Tabla 3,

(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o

(v) los sitios CHH de la región D-loop mostrados en la Tabla 5.

17. Un kit que comprende al menos un oligonucleótido capaz de hibridar específicamente con una zona en posición 5 o en posición 3 con respecto a un sitio de metilación en el ADN mitocondrial seleccionado del grupo formado por:

(i) los sitios CpG de la región D-loop mostrados en la Tabla 1,

(ii) los sitios CpG del gen ND1 mostrados en la Tabla 2;

(iii) los sitios CHG de la región D-loop mostrados en la Tabla 3,

(iv) los sitios CHG del gen ND1 mostrados en la Tabla 4, y/o

(v) los sitios CHH de la región D-loop mostrados en la Tabla 5

en donde la citosina metilada en dicha posición se ha convertido a uracilo o a otra base que es distinguible de citosina en sus propiedades de hibridación.

18. Un kit según la reivindicación 17, en donde dicho al menos un oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5.

19. Uso de un kit de acuerdo a las reivindicaciones 16 a 18 para determinar el patrón de metilación del ADN mitocondrial o para determinar el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto seleccionada de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.