Liposomas anfóteros que comprenden lípidos imino.

Complejos lipídicos que comprenden anfífilos aniónicos y catiónicos; en los que al menos una parte de los anfífilos catiónicos son lípidos imino que están cargados sustancialmente en condiciones fisiológicas

, y en los que los anfífilos aniónicos son lípidos de carboxilo o fosfato y en los que además la relación de carga entre los anfífilos catiónicos y aniónicos es< 1.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2010/059487.

Solicitante: Marina Biotech, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 3830 Monte Villa Parkway Bothell WA 98021-7266 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: PANZNER,STEFFEN, Siepi,Evgenios.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K48/00 (Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales caracterizadas por un aspecto... > A61K9/127 (Liposomas)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales caracterizadas por un aspecto... > A61K9/133 (Vesículas unilaminares)

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Fragmento de la descripción:

Liposomas anfóteros que comprenden lípidos imino

Campo de la invención 5

La presente invención se refiere a complejos lipídicos o liposomas que son capaces de superar un bloqueo de captación mediado por lipoproteínas. Más específicamente, esta invención se refiere a mejoras en los liposomas que comprenden lípidos con carga negativa que tienen un grupo principal carboxílico o de fosfato y lípidos de carga positiva que tienen fracciones imino o guanido o derivados de los mismos en las regiones polares respectivas. 10

Antecedentes de la invención

Los liposomas tienen un uso extenso como portadores de ingredientes activos. Los liposomas neutros o con carga negativa se usan a menudo para el suministro de fármacos de moléculas pequeñas, mientras que los de carga 15 positiva (catiónicos) o la recientemente introducida clase de liposomas anfóteros se usan principalmente para el suministro de ácidos nucleicos tales como plásmidos u oligonucleótidos. Entre los ejemplos importantes de liposomas catiónicos usados para el suministro de cargas en ácidos nucleicos se incluyen, pero no se limitan a Semple y col., Nat. Biotech. (2010) 28:172-176; Akinc y col., Nat. Biotech. (2008) 26:561 -569; Chien y col., Cancer Gene Ther. (2005) 12:321-328; de Fougerolles, Nat. Rev. Drug Discov. (2007) 6:443-453; Kim y col., Mol. Ther. 20 (2006) 14:343-350; Morrissey, Nat. Biotech. (2005) 23: 1002-1007; Peer, Science (2008) 319: 627-630 y Santel, Gene Ther. (2006) 13: 1222-1234. La aplicación de liposomas anfóteros para el suministro de ácidos nucleicos se ha mostrado en Andreakos y col., Arthritis Rheum. (2009) 60:994-1005.

Los liposomas anfóteros pertenecen a la gran familia de liposomas sensibles al pH, que comprenden además 25 liposomas aniónicos o catiónicos sensibles al pH, de los que se han presentado prototipos en Lai y col., Biochemistr y (1985) 24:1654-1661 y Budker y col., Nat. Biotech. (1996) 14:760-764. A diferencia de los liposomas aniónicos o catiónicos sensibles al pH, los liposomas anfóteros son estructuras complejas y comprenden al menos un par de lípidos que tienen carga complementaria. El documento WO-02/066.012 desvela una característica clave de liposomas anfóteros en la que tienen una fase estable para pH bajo y neutro. Los documentos WO-02/066.012 y 30 WO-07/10.730 describen un procedimiento de carga de dichas partículas con ácidos nucleicos a partir de un pH bajo.

Hafez, y col. (Biophys. J. 2000, 79 (3) , 1438-1446) y el documento WO-02/066.012 proporcionan alguna información sobre cómo seleccionar mezclas de lípidos con verdaderas propiedades anfóteras y más específicamente cómo 35 determinar su punto isoeléctrico y el inicio de la fusión. Los lípidos neutros pueden ser constituyentes adicionales de liposomas anfóteros. La inclusión de uno o más de dichos lípidos neutros añade una complejidad considerable a la mezcla, especialmente porque las cantidades individuales de todos los componentes pueden variar. El número muy elevado de posibles combinaciones de lípidos representa un obstáculo práctico hacia una optimización más rápida de liposomas anfóteros. A este respecto, el documento WO-08/043.575 revela estrategias para la optimización de la 40 estabilidad, la fusogenicidad y la transfección celular de liposomas anfóteros, en particular un procedimiento para predecir las mezclas de lípidos que forman fases laminares satisfactoriamente estables para pH altos y bajos, a la vez que forman una fase hexagonal fusógena para un pH intermedio.

Los liposomas anfóteros de acuerdo con las referencias mencionadas anteriormente son potentes transfectantes de 45 células. Sin embargo, se ha observado que la función de algunos de estos liposomas podría ser bloqueada por la adición de determinados sueros, lo que limitaría potencialmente la actividad de estos liposomas para el direccionamiento de determinadas células in vivo. Esta cuestión se ilustra adicionalmente en los Ejemplos presentados en la presente memoria descriptiva, por ejemplo, el Ejemplo 3.

La inhibición de la captación de liposomas anfóteros observada en diferentes sueros es aparentemente opuesta a la activación publicada recientemente de soporte catiónico a través de la formación compleja con lipoproteínas, en este caso ApoE, tal como se demuestra en Akinc y col., Mol. Ther. (2010) , publicación electrónica del 11 de mayo, antes de imprenta. DOI: 10.1038/mt.2010.85

Una investigación más detallada reveló lipoproteínas como mediadores de este efecto inhibidor. Tal como se muestra en el Ejemplo 4 en la presente memoria descriptiva, el suero humano deficiente en lipoproteínas deja de ser capaz de inhibir la captación de liposomas tal como se indica por el suministro funcional de ARNip en células diana. Los autores de la invención han encontrado de forma sorprendente e inesperada que algunas especies de lípidos imino catiónicos en combinación con lípidos aniónicos que tienen una fracción de carboxilo o fosfato en sus grupos 60 principales polares son especialmente ventajosas para mantener la actividad de transfección en presencia de suero. Frecuentemente, se observó una ventaja especial cuando los complejos lipídicos o liposomas creados a partir de dichas mezclas de lípidos se formularon de acuerdo con el procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva y en el documento WO-08/043.575.

Objeto de la invención Por tanto un objeto de la invención es proporcionar complejos lipídicos o liposomas que pueden transfectar células en presencia de diversos sueros.

Otro objeto de la invención es proporcionar composiciones farmacéuticas que comprenden dichos liposomas como soporte para el suministro de agentes o ingredientes activos, lo que incluye fármacos tales como fármacos de ácidos 10 nucleicos, por ejemplo, oligonucleótidos y plásmidos en células o tejidos.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona complejos lipídicos, liposomas y su uso para transfección de células en los que 15 dichos complejos lipídicos comprenden anfífilos aniónicos y catiónicos y en los que al menos una parte de los anfífilos catiónicos son lípidos imino que se cargan sustancialmente a pH 7, 5, y en los que los anfífilos aniónicos son lípidos de carboxilo o fosfato y en los que además la relación de carga entre los anfífilos catiónicos y aniónicos es de 1, 5 o menos.

En varias realizaciones de la invención, se proporcionan complejos lipídicos que comprenden anfífilos aniónicos y catiónicos en los que al menos una parte de los anfífilos catiónicos son lípidos imino que se cargan sustancialmente en condiciones fisiológicas, y en los que además al menos una parte de los anfífilos aniónicos son lípidos carboxílicos, y en los que la relación entre los anfífilos catiónicos y aniónicos es inferior o igual a 1, 5.

En aspectos más específicos de la invención, se proporcionan complejos lipídicos que comprenden una combinación de lípidos en los que los lípidos catiónicos de dicha combinación comprenden una fracción guanido y los lípidos aniónicos de dicha combinación comprenden un grupo carboxilo, caracterizados además porque la relación entre las fracciones guanido y los grupos carboxilo es inferior o igual a 1, 5.

En otras realizaciones de la invención, se proporcionan complejos lipídicos que comprenden anfífilos aniónicos y catiónicos en los que al menos una parte de los anfífilos catiónicos son lípidos imino que se cargan sustancialmente en condiciones fisiológicas, y en los que además al menos una parte de los anfífilos aniónicos son lípidos de fosfato, y en los que la relación entre los anfífilos catiónicos y aniónicos es inferior o igual a 1, 5. En aspectos más preferidos de dichas realizaciones,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Complejos lipídicos que comprenden anfífilos aniónicos y catiónicos; en los que al menos una parte de los anfífilos catiónicos son lípidos imino que están cargados sustancialmente en condiciones fisiológicas, y en los que los anfífilos aniónicos son lípidos de carboxilo o fosfato y en los que además la relación de carga entre los 5 anfífilos catiónicos y aniónicos es < 1.

2. Complejos lipídicos de acuerdo con la reivindicación 1, en los que al menos una parte de los anfífilos aniónicos son lípidos carboxílicos.

3. Complejos lipídicos de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprenden una combinación de lípidos, en los que los lípidos catiónicos de dicha combinación comprenden una fracción guanido y los lípidos aniónicos de dicha combinación comprenden un grupo carboxilo, caracterizados porque además la relación entre las fracciones guanido y los grupos carboxilo es < 1.

4. Complejos lipídicos de acuerdo con la reivindicación 1, en los que al menos una parte de los anfífilos aniónicos son lípidos de fosfato.

5. Complejos lipídicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizados porque además los grupos imino cargados de los anfífilos catiónicos tienen un pK de más de 7, 5 y se seleccionan entre 20 iminas, amidinas, piridinas, 2-aminopiridinas, bases de nitrógeno heterocíclicas, fracciones guanido, isoureas y tioisoureas.

6. Complejos lipídicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en los que los anfífilos catiónicos se seleccionan entre el grupo que comprende las estructuras de I1 a I113, las estructuras A1 a A21 o las 25 estructuras L1 a L17, en los que los miembros de dicho grupo se seleccionan además de acuerdo con un pK superior a 7, 5.

7. Complejos lipídicos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizados porque además los lípidos catiónicos se seleccionan entre el grupo de PONA, CHOLGUA, 30 GUADACA, MPDACA y SAINT-18.

8. Complejos lipídicos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizados porque además los lípidos aniónicos se seleccionan entre el grupo de CHEMS, DMGS, DOGS, DOPA y POPA. 35

9. Complejos lipídicos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizados porque además dichos complejos tienen una relación de carga de los lípidos catiónicos y aniónicos de entre 0, 5 y < 1.

10. Complejos lipídicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizados porque además dichos complejos son liposomas.

11. Liposomas de acuerdo con la reivindicación 10, que comprenden además (a) un lípido neutro o zwitteriano seleccionado entre colesterol, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, esfingomielina y mezclas de los 45 mismos, o (b) lípidos PEG.

12. Liposomas de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizados porque además el lípido neutro es colesterol y la fracción molar de colesterol en la mezcla de lípidos se encuentra entre el 10 y el 50% en moles, o porque los lípidos PEG están situados en la hoja de membrana más externa. 50

13. Liposomas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones a 12, que comprenden además un oligonucleótido.

14. Liposomas de acuerdo con la reivindicación 13, en los que dicho oligonucleótido es un oligonucleótido 55 señuelo, un oligonucleótido antisentido, un ARNip, un agente que influye en la transcripción, una ribozima, una ADNzima o un aptámero.

15. Liposomas de acuerdo con la reivindicación 14, en los que dichos oligonucleótidos comprenden nucleósidos modificados tales como ADN, ARN, ANB, ANP, ARN 2’OMe, ARN 2’MOE, ARN 2’F en sus formas de 60 fosfodiéster o fosfotioato.

16. Uso de los liposomas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 para la transfección de células in vitro o ex vivo.

17. Un aerosol que comprende liposomas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 para su uso en la transfección de células pulmonares. 5