Procedimiento de producción de lipasa, célula de Yarrowia lipolytica transformada apta para producir dicha lipasa y sus aplicaciones.

Procedimiento de producción de lipasa recombinante que comprende:

a) una etapa en el transcurso de la cual se procede a la puesta en cultivo de células de Yarrowia lipolytica transformadas por un vector de expresión que comprende un módulo de expresión de una lipasa acidorresistente de levadura

, y

b) una etapa en el transcurso de la cual se recoge, en el sobrenadante de dicho cultivo, la lipasa recombinante producida por dichas células;

estando caracterizado dicho procedimiento porque la etapa a) de puesta en cultivo se pone en práctica en un medio de cultivo desprovisto de productos de origen animal o de mezclas no caracterizadas constituidas por materiales proteicos de origen animal o de sus productos de digestión enzimática,

y porque dicha etapa a) comprende:

a1) el precultivo de las células transformadas de Yarrowia lipolytica en un medio que contiene una fuente de carbono de origen glucídico, nitrógeno mineral y sales minerales, oligoelementos y vitaminas; y

a2) una etapa de fermentación que comprende una fase de crecimiento celular en un medio que contiene como única fuente de carbono una fuente de carbono de origen glucídico, nitrógeno mineral y sales minerales, oligoelementos y vitaminas, y una fase de producción de lipasa en un medio que contiene como única fuente de carbono ácido oleico, nitrógeno mineral y sales minerales, oligoelementos y vitaminas.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FR2006/001352.

Solicitante: LABORATOIRES MAYOLY SPINDLER.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 6, AVENUE DE L'EUROPE 78400 CHATOU FRANCIA.

Inventor/es: MARTY, ALAIN, LEBLOND,YVES, MOUZ,NICOLAS, URIBELARREA,JEAN-LOUIS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K38/00 (Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/02 (que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/20 (Escisión de triglicéridos, p. ej. por medio de lipasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/39 (de levaduras)

PDF original: ES-2550537_T3.pdf

 

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Procedimiento de producción de lipasa, célula de Yarrowia lipolytica transformada apta para producir dicha lipasa y sus aplicaciones.
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Fragmento de la descripción:

Procedimiento de producción de lipasa, célula de Yarrowia lipolytica transformada apta para producir dicha lipasa y sus aplicaciones

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de lipasa que emplea células de levadura Yarrowia lipolytica productoras de una lipasa recombinante acidorresistente, permitiendo dicho procedimiento la obtención de una lipasa apta para emplearse como medicamento; la presente invención se refiere igualmente a una cepa de Yarrowia lipolytica sobreproductora de lipasa recombinante acidorresistente y a sus aplicaciones.

Los alimentos ingeridos diariamente por el hombre están constituidos esencialmente por lípidos, proteínas y azúcares. Todos estos constituyentes experimentan, antes de su absorción, una hidrólisis catalizada por las enzimas del tracto digestivo. Un déficit de alguna de estas enzimas puede conllevar por tanto problemas digestivos y conducir a una desnutrición importante. Es por ejemplo el caso en ciertas situaciones patológicas, como la muscoviscidosis o la insuficiencia pancreática exocrina, a las que está asociado un déficit de lipasa pancreática. Se ha propuesto clásicamente para corregir este déficit administrar por vía oral extractos pancreáticos. Sin embargo, la eficacia de esta terapia está limitada por el hecho de que las enzimas contenidas en estos extractos (lipasas, amilasas y proteasas) se inactivan rápidamente por la acidez del medio gástrico.

Se ha propuesto por tanto utilizar preparaciones de lipasas que resistan a las condiciones gástricas, tales como por ejemplo preparaciones de lipasa gástrica de mamíferos producidas por ingeniería genética, como la descrita en la solicitud de patente francesa publicada con el número 2.699.179 a nombre del INSTITUI DE RECHERCHE JOUVENIAL SA o preparaciones de lipasas de microorganismos que posean una actividad correcta en medio ácido [ZENTLER-MONRO et al.. Páncreas, 7, 311-319(1992)].

Entre las lipasas de microorganismos activas en medio ácido, se citarán en particular las lipasas fúngicas, tales como las de Candida ernobii, [YOSHIDA et al., Biochim. Biophvs, Acta; 154, 586-588, (1968)], de Trichosporon asteroide [DHARMSTHITI et al., Biotechnol. AppI. Biochem., 26, 111-116 (1997)], de Rhizopus javanicus [(UYTTENBROECK et al., Biol. Chem. Hoppe Sevler. 374, 245-254, (1993)] o de Yarrowia lipolytica [HADEBALL, Acta Biotechnol.. 2, 159-167 (1991); NOVOTNY et al., J. Basic Microbiol., 28, 221-227 (1988)]. Además de su actividad a pH ácido, estas lipasas presentan las características comunes de ser resistentes, en presencia de su sustrato, a la digestión por proteasas (tripsina, quimotripsina y pepsina) y de ser resistentes a la acción de las sales biliares (su actividad se conserva en presencia de taurocolato de sodio 10 mM).

Se ha descrito ya la utilización de Yarrowia lipolytica para la producción de un gen de interés. Así, la solicitud EP 1.108.043, a nombre del INRAy del CNRS, describe la utilización de un vector ¡ntegrativo que comprende un módulo de expresión de un gen de interés y secuencias zeta, correspondientes a las secuencias de LTR del retrotransposón Ylt de Yarrowia lipolytica. Dicho vector de expresión permite la integración no homologa y dispersada de varias copias del inserto de interés en el ADN genómico de una cepa de Yarrowia lipolytica desprovista de secuencias zeta. Este sistema se ha usado especialmente para la integración del gen LIP2 que codifica una lipasa en el ADN de Yarrowia lipolytica y ha permitido, en condiciones de cultivo que no se detallan, una secreción de lipasa de 10 a 15 veces superior a la de cepas no transformadas.

Otros estudios describen la utilización del mismo vector de expresión que el descrito en la solicitud de patente EP 1.108.043 para la producción de una lipasa recombinante en Yarrowia lipolytica (solicitud internacional WO 01/83773; PIGNEDE et al., Journal of Bacterioloav. vol. 182, n° 10, pág. 2802-2810 (2000) y PIGNEDE et al., Applied and Enviromnental Microbioloqy. vol. 66, n° 8, p3283-3289 (2000). Así:

La solicitud internacional WO 01/83773, a nombre de Laboratoires MAYOLY SPINDLER, describe la obtención del clon de Yarrowia lipolytica MS4 (CNCM I-2294) que comprende 10 copias del módulo de expresión del gen LIP2 integradas en su ADN, así como su utilización para la producción de lipasa con un rendimiento del orden de 0,5 g de lipasa por litro de sobrenadante de cultivo, y una actividad catalítica de 12.000 U/ml, medida usando aceite de oliva como sustrato, correspondiendo una unidad a la cantidad de enzima capaz de catalizar la liberación de 1 pmol de ácido graso por minuto, es decir, 200 veces más que la cepa inicial. No obstante, el procedimiento de producción de lipasa descrito en esta solicitud presenta un inconveniente importante, ya que emplea medios de cultivo que contienen bactopeptona o bactotriptona. Estos productos, que no están caracterizados y que contienen diversos hidrolizados proteicos, se utilizan clásicamente como fuente de nitrógeno y carbono. En consecuencia, el procedimiento descrito en esta solicitud no permite obtener una lipasa directamente utilizable como medicamento.

PIGNEDE et al. (Journal of Bacterioloav. 2000) han caracterizado más particularmente la lipasa extracelular codificada por el gen LIP2 de Yarrowia lipolytica (cepa P01d). En este artículo, se han estudiado así:

la secreción de la lipasa a partir de diferentes cepas silvestres (P01d en la que Yltl está ausente y E150 en la que Yltl está presente) y de diferentes cepas recombinantes como JMY184 (P01d-6- 15) y JMY279 (P01d-6-17), así como

la sobreproducción de lipasa especialmente por el transformante JMY184.

Este artículo de PIGNEDE et al. compara la producción de lipasa por cepas silvestres, cepas mutantes y cepas recombinantes obtenidas según el procedimiento descrito anteriormente (solicitud internacional WO 01/83773). Las cepas silvestres secretan entre 30 y 50 U de lipasa/ml, mientras que las cepas mutantes obtenidas por la acción de la A/-metil-A/'-nitro-A/-nitrosoguanidina (NNNG) producen 25 veces más lipasa, es decir, 1.200 U/ml en condiciones de cultivo optimizadas que hacen intervenir un medio que contiene peptona (medio de precultivo) y un medio que contiene suero lácteo (medio de fermentación) (véase igualmente DESTAIN et al., 1997). Se obtienen las cepas recombinantes con la ayuda de la construcción que comprende el gen LIP2 regulado por el promotor POX2 y mediante integración no homologa, en copias múltiples y de forma dispersada, de este módulo de expresión. PIGNEDE et al. han obtenido transformantes estables (por ejemplo, la cepa JMY184) que producen 2.000 U/ml en condiciones no optimizadas, es decir, en medio YPDH (que comprende 10 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de bactopeptona, 10 g/l de glucosa y 10 g/ de aceite de oliva) correspondientes a aproximadamente 0,5 g de lipasa/l de sobrenadante. De la misma manera que anteriormente, las preparaciones de lipasa descritas por PIGNEDE et al. y por DESTAIN et al., son inapropiadas, como tales, para un uso médico y más particularmente para la constitución de lotes clínicos, ya que su producción requiere la utilización de medios de cultivo que contienen peptonas o suero láctico.

Prosiguiendo sus trabajos, el equipo de PIGNEDE (Applied and Environmental Microbioloqy. 2000) ha estudiado cepas de Yarrowia lipolytica transformadas por un vector que comprende un módulo de expresión del gen LIP2. Los autores han determinado que, para 8 de estos transformantes, el número de copias del módulo de expresión del gen LIP2 está comprendido entre 6 y 16 (10 copias de media), lo que se traduce en 2 a 15 eventos de integración de dicho módulo en loci diferentes. La cepa JMY184 comprende así 12 copias del módulo de expresión del gen LIP2,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento de producción de lipasa recombinante que comprende:

a) una etapa en el transcurso de la cual se procede a la puesta en cultivo de células de Yarrowia lipolytica transformadas por un vector de expresión que comprende un módulo de expresión de una lipasa acidorresistente de levadura, y

b) una etapa en el transcurso de la cual se recoge, en el sobrenadante de dicho cultivo, la lipasa recombinante producida por dichas células;

estando caracterizado dicho procedimiento porque la etapa a) de puesta en cultivo se pone en práctica en un medio de cultivo desprovisto de productos de origen animal o de mezclas no caracterizadas constituidas por materiales proteicos de origen animal o de sus productos de digestión enzimática,

y porque dicha etapa a) comprende:

a1) el precultivo de las células transformadas de Yarrowia lipolytica en un medio que contiene una fuente de carbono de origen glucídico, nitrógeno mineral y sales minerales, oligoelementos y vitaminas; y

a2) una etapa de fermentación que comprende una fase de crecimiento celular en un medio que contiene como única fuente de carbono una fuente de carbono de origen glucídico, nitrógeno mineral y sales minerales, oligoelementos y vitaminas, y una fase de producción de lipasa en un medio que contiene como única fuente de carbono ácido oleico, nitrógeno mineral y sales minerales, oligoelementos y vitaminas.

2. Procedimiento de producción de lipasa recombinante según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha fuente de nitrógeno es sulfato de amonio.

3. Procedimiento de producción según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la fermentación se pone en práctica ventajosamente con una pC>2 constante comprendida entre 15 y 25 % y un pH preferiblemente inferior a 6,5.

4. Procedimiento de producción según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, caracterizado porque la etapa a1) de precultivo se realiza hasta alcanzar un valor de DOsoonm comprendido entre 3 y 10 para 1 mi, y porque en la etapa a2) de fermentación dicha fase de producción de lipasa se inicia cuando la DOeoonm del cultivo alcanza un valor comprendido entre 60 y 80 para 1 mi.

5. Procedimiento de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la etapa b) en el transcurso de la cual se recoge la lipasa se realiza cuando la DOeoonm alcanza un valor comprendido entre 300 y 350 para 1 mi.

6. Procedimiento de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la etapa b) comprende:

b1) la separación de la lipasa de dicho sobrenadante de cultivo, y

b2) la purificación de la lipasa obtenida en b1).

7. Procedimiento de producción según la reivindicación 6, caracterizado porque dicha separación se efectúa mediante una técnica elegida entre filtración tangencial en fibra hueca, filtración frontal y centrifugación continua o discontinua, y dicha purificación se efectúa mediante una técnica elegida entre filtración, precipitación fraccionada, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía por filtración en gel.

8. Procedimiento de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la etapa a) consiste en la puesta en cultivo del clon denominado YL-LIP2-6C, depositado en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), 28 rué du Docteur Roux, 75724 París Cedex 15, con el número I-3542, el 15 de diciembre de 2005.

9. Preparación de la lipasa recombinante acidorresistente de levadura codificada por el gen Lip2 o LIP2, caracterizada porque es susceptible de obtenerse mediante un procedimiento según la reivindicación 8, porque tiene una actividad catalítica a pH 6 de al menos 15.000 unidades por mi de sobrenadante de cultivo, preferiblemente superior a 20.000 unidades por mi de sobrenadante de cultivo, correspondiendo una unidad a la cantidad de enzima capaz de catalizar la liberación de 1 pmol de ácido graso por minuto cuando el sustrato utilizado es trioctanoína, y porque la concentración de dicha lipasa en dicha preparación es superior a 1 g de lipasa por litro.

10. Utilización de una preparación de lipasa según la reivindicación 9 para la obtención de un medicamento destinado al tratamiento de un síndrome de malabsorción de grasas, ligado a una insuficiencia pancreática.

11. Preparación de lipasa según la reivindicación 9 para utilización como medicamento.

12. Célula de Yarrowia lipolytica transformada por un vector que comprende un módulo de expresión de una lipasa extracelular acidorreslstente de levadura, caracterizada porque se trata del clon denominado YL-LIP2-6C, depositado en la Collectlon Natlonale de Cultures de Microorganlsmes (C.N.C.M.) con el número I-3542, el 15 de diciembre de 2005.

5 13. Utilización de la célula según la reivindicación 12 para la producción de la lipasa acidorreslstente de

levadura codificada por el gen Llp2 o LIP2.