Línea celular MDCK no tumorigénica para propagar virus.

Línea celular de riñón canino Madin Darby (MDCK) no tumorigénica MDCK-SF103 depositada como número de registro de ATCC PTA-6503.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11004971.

Solicitante: MEDIMMUNE, LLC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: ONE MEDIMMUNE WAY GAITHERSBURG, MD 20878 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: SCHWARTZ,Richard, BERRY,John Michael, SUBRAMANIAN,Ajit, SHI,Xiao.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N5/00 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).
  • C12N7/00 C12N […] › Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00).

PDF original: ES-2526170_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Línea celular MDCK no tumorigénica para propagar virus Campo de la invención

La presente invención se refiere a una línea de células MDCK no tumorigénicas novedosa tal como se define mediante las reivindicaciones, que puede usarse para la producción de material de vacuna. La línea de células MDCK no tumorigénicas está adaptada a medio de cultivo libre de suero. También se describen en el presente documento formulaciones de medios y métodos de cultivo para la propagación de las células MDCK no tumorigénicas así como métodos para mantener la naturaleza no tumorigénica de las líneas celulares de la invención. También se describen en el presente documento procedimientos para la producción de virus influenza en cultivo celular usando células MDCK no tumorigénicas. También se describen en el presente documento virus (por ejemplo, influenza) que pueden obtenerse mediante el procedimiento descrito y composiciones inmunogénicas que contienen virus de este tipo y/o componentes de los mismos.

Antecedentes de la invención

La vacunación es la medida de salud pública más importante para prevenir la enfermedad provocada por las epidemias anuales de gripe. El uso eficaz de las vacunas depende de poder producir rápidamente grandes cantidades de material de vacuna (por ejemplo, virus) a partir de una fuente estable y fácil de cultivar. El desarrollo rápido de las vacunas y su disponibilidad abundante son críticos en la lucha contra muchas enfermedades humanas y animales. Los retrasos en la producción de vacunas y la escasez en su cantidad pueden provocar problemas al abordar los brotes de la enfermedad. Por ejemplo, recientes estudios sugieren que hay un motivo de preocupación referente a los largos plazos de entrega requeridos para producir vacunas contra la gripe pandémica. Véase, por ejemplo, Wood, J. M., 2001, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 356:1953. La producción eficaz de vacunas requiere el crecimiento de grandes cantidades de material de vacuna producido en altos rendimientos a partir de un sistema huésped. Diferentes materiales de vacuna requieren diferentes condiciones de crecimiento con el fin de obtener rendimientos aceptables. Puede producirse material de vacuna en huevos embrionados, células de cultivo tisular primarias o en líneas celulares establecidas. Sin embargo, estos sistemas huésped padecen actualmente varias limitaciones detalladas a continuación.

Se usan normalmente huevos embrionados para la producción de virus de vacunas contra la gripe en un proceso intensivo de tiempo, trabajo y coste que necesita el manejo de la cría de pollos y la fertilización de huevos. Además, la vacuna contra la gripe producida en huevos está contraindicada para personas con alergias al huevo debido a la reacción de hipersensibilidad inmediata grave que puede producirse. Por tanto, la industria de las vacunas ha realizado un esfuerzo para desarrollar plataformas de producción alternativas que no utilizan huevos tales como producir la vacuna contra la gripe en un sistema de cultivo celular.

El uso de células de cultivo tisular primarias se ve obstaculizado por las dificultades encontradas en el desarrollo y el mantenimiento de una población de células primarias estables. A menudo, se usan líneas celulares establecidas para sortear las limitaciones técnicas de las células primarias. Sin embargo, se sabe que muchas de estas líneas celulares son tumorigénicas y como tales surgen problemas de seguridad y se ven sometidas a limitaciones regulatorias significativas con respecto a su uso para la producción de vacunas. De hecho, las directrices aplicables de la Organización Mundial de la Salud indican que sólo unas pocas líneas celulares están permitidas para la producción de vacunas. Surgen problemas adicionales del uso de aditivos de suero y/o proteína derivados de fuentes animales o humanas en medios de cultivo celular. Por ejemplo, se conocen bien la variabilidad en la calidad y composición entre lotes de aditivos y el riesgo de contaminación con micoplasmas, virus, agentes de BSE y otros agentes infecciosos. En general, el suero o las sustancias derivadas del suero como albúmina, transferrina o insulina pueden contener agentes no deseados que pueden contaminar el cultivo y los productos biológicos producidos a partir del mismo. Por tanto, muchos grupos están trabajando para desarrollar condiciones de cultivo y sistemas huésped eficaces que no requieren suero o productos derivados del suero.

En consecuencia, ha habido una demanda para el establecimiento de una línea celular no tumorigénica útil para la producción de materiales de vacuna de una manera estable, altamente segura y de bajo coste preferiblemente en condiciones de cultivo libre de suero o libre de proteínas animales. Un sistema celular de este tipo sería particularmente útil para la producción de material de vacuna contra la gripe.

Se han usado tradicionalmente células de riñón canino Madin Darby (MDCK) para la titulación de virus influenza (Zambón M., en Textbook of Influenza, ed Nicholson, Webster y Hay, cap. 22, págs. 291-313, Blackwell Science (1998)). Estas células se establecieron en 1958 a partir del riñón de un cocker spaniel macho normal. En la ATCC figura que la línea MDCK (CCL 34) ha sido depositada por S. Madin y N. B. Darby, sin embargo, están disponibles otros numerosos linajes de células MDCK. Leighton J y sus colaboradores publicaron una serie de artículos (Leighton et al., 1968, Science 163:472; Leighton et al., 1970, Cáncer 26:1022 y Leighton et al., 1971 Europ J. Cáncer 8:281) que documentan las características oncogénicas de las células MDCK. Sin embargo, el linaje y el número de pases de las células MDCK para estos estudios no se describió y ya se sabía que células MDCK de

diferentes linajes y diferentes pases mostraban cambios en el número y la estructura de los cromosomas (Gaush et al., 1966, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 122: 93 1) que podrían dar como resultado células con propiedades tumorigénicas.

Puesto que una de las principales consideraciones para la aceptabilidad de una línea celular para la producción de vacunas se refiere al potencial maligno de esas células, el uso de células MDCK para la producción de material de vacuna usando líneas celulares descritas en la actualidad es limitado. Groner et al. (patente estadounidense 6.656.720) y Makizumi et al. (patente estadounidense 6.825.036) pretenden ambos dar a conocer líneas celulares derivadas de células MDCK que se han adaptado a crecer en medios libre de suero en suspensión y que pueden utilizarse para la producción de virus influenza. Sin embargo, se ha notificado que hay una correlación entre la pérdida del requisito de anclaje y la transformación de células animales normales a células que son tumorigénicas (Stiles et al., 1976, Cáncer Res., 36:3300). Varios grupos (Kessler et al., 1999, Cell Culture Dev Biol Stand, 98:13; Merten et al., 1999, Cell Culture Dev Biol Stand, 98:23 y Tree et al., 2001, Vaccine, 19:3444) pretenden describir el uso de células MDCK para la producción a gran escala de virus influenza; sin embargo, no abordan la posible transformación de las células MDCK usadas.

Palache et al. (1997), The Journal of Infectious Diseases, 176 (Supl. I): S20-S23 describen las líneas de células MDCK MCS-MDCK ATCC-52 DU4 y WC5-MDCK ATCC-52 DU5, que se obtuvieron cultivando células MDCK en medio libre de suero. Además, Tree et al. (2001) Vaccine, 19:3444-3450 se refieren a las líneas celulares MDCK CCL34 (dependiente de suero) y MDCK CCL 34.2 (adaptada a medio libre de suero).

La mención o discusión de una referencia en el presente documento no debe interpretarse como una admisión de que tal es técnica anterior a la presente invención. Además, la mención de una patente no debe interpretarse como una admisión de su validez.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una línea celular MDCK no tumorigénica tal como se define mediante las reivindicaciones que se ha adaptado a crecer en formulaciones de medios libres de suero incluyendo formulaciones libres de proteínas animales (APF). Las células MDCK no tumorigénicas de la invención son adherentes. Las células MDCK no tumorigénicas de la invención tienen una morfología epitelial. Por tanto, las células MDCK no tumorigénicas de la invención son adherentes y tienen una morfología epitelial. La tumorigenicidad, en una realización, se determina mediante el modelo de ratón desnudo adulto (por ejemplo, Stiles et al., 1976, Cáncer Res, 36:1353, y ejemplo 2 más adelante). La tumorigenicidad también puede someterse a prueba mediante otros ensayos, por ejemplo, mediante inyección en un embrión de pollo y/o aplicación tópica al corioalantoides (Leighton etal., 1970, Cáncer,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Línea celular de riñón canino Madin Darby (MDCK) no tumorigénica MDCK-SF103 depositada como número de registro de ATCC PTA-6503.

2. Línea celular MDCK no tumorigénica según la reivindicación 1, en la que la línea celular no es tumorigénica en un modelo de ratón desnudo adulto.

3. Línea celular MDCK no tumorigénica según la reivindicación 1 ó 2, en la que la línea celular sigue siendo no tumorigénica tras al menos 20 pases.

4. Composición de cultivo celular que comprende células MDCK no tumorigénicas de la línea celular MDCK no tumorigénica según la reivindicación 1,2 ó 3.

5. Composición de cultivo celular según la reivindicación 4, en la que la composición comprende medio libre de suero.

6. Composición de cultivo celular según la reivindicación 5, en la que el medio comprende SF de Taub, lípidos, hidrolizado de trigo y EGF a una concentración de 10 ng/ml, comprendiendo SF de Taub una mezcla 50:50 de DMEM y F12 de Flam complementada con hormonas, insulina 5 pg/ml, transferrina 5 pg/ml, prostaglandina E1 25 ng/ml, hidrocortisona 50 nM, triyodotironina 5 pM, Na2Se03 10 nM, glucosa 4,5 g/l, NaHCC>3 2,2 g/l y L-glutamina 4 mM.

7. Composición de cultivo celular según la reivindicación 6, en la que el medio comprende además tropolona y una fuente de hierro y carece de transferrina, seleccionándose la fuente de hierro de citrato de amonio férrico y sulfato de amonio férrico.

8. Composición de cultivo celular según la reivindicación 7, en la que las razones de citrato de amonio férrico:tropolona o sulfato de amonio férrico:tropolona son de entre 10 a 1 y 70 a 1.

9. Uso de la línea celular no tumorigénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la producción de virus influenza.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que el virus influenza es un virus influenza reordenante que comprende antígenos de hemaglutinina y/o neuraminidasa en el contexto de una cepa maestra atenuada, sensible a la temperatura o adaptada al frío.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que la cepa maestra se selecciona de A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, PR8, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 y B/England/2608/76.

12. Uso según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que los antígenos de hemaglutinina y/o neuraminidasa proceden de un genoma de influenza A.

13. Uso según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que los antígenos de hemaglutinina y/o neuraminidasa proceden de un genoma de influenza B.


 

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