Ligandos de cromatografía estables en medio cáustico.

Un ligando de cromatografía estable en medio alcalino que comprende dos o más dominios B o dos o másdominios Z de la proteína A de Staphylococcus (SpA),

en el que dominio B comprende la secuencia de aminoácidosexpuesta en la SEC ID Nº: 10, y el dominio Z comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº:12, en el que los dos o más dominios B o los dos o más dominios Z se unen a una resina de cromatografía en másde un sitio sobre la resina mediante una unión multipunto, y adicionalmente en el que el ligando conserva al menosel 95 % de su capacidad de unión después de 5 horas de incubación en NaOH 0,5 M.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E09180615.

Solicitante: EMD Millipore Corporation.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 290 CONCORD ROAD BILLERICA MASSACHUSETTS 01821 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: BIAN, NANYING, SOICE,NEIL, SPECTOR,SHARI, LEVINE,KARA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • B01D15/38 TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES.B01 PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL.B01D SEPARACION (separación de sólidos por vía húmeda B03B, B03D, mesas o cribas neumáticas B03B, por vía seca B07; separación magnética o electrostática de materiales sólidos a partir de materiales sólidos o de fluidos, separación mediante campos eléctricos de alta tensión B03C; aparatos centrifugadores B04B; aparato de vórtice B04C; prensas en sí para exprimir los líquidos de las sustancias que los contienen B30B 9/02). › B01D 15/00 Procedimientos de separación que implican el tratamientos de líquidos con absorbentes sólidos; Aparatos para ello. › implicando una interacción no cubierta por uno o varios grupos B01D 15/30 - B01D 15/36, p.ej. afinidad, intercambio de ligando o cromatografía quiral.
  • B01J20/286 B01 […] › B01J PROCEDIMIENTOS QUÍMICOS O FÍSICOS, p. ej. CATÁLISIS O QUÍMICA DE LOS COLOIDES; APARATOS ADECUADOS. › B01J 20/00 Composiciones absorbentes o adsorbentes sólidas o composiciones que facilitan la filtración; Absorbentes o adsorbentes para cromatografía; Procedimientos para su preparación, regeneración o reactivación. › Fases unidas químicamente a un substrato, p.ej. a sílice o a polímeros.
  • C07K14/31 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Staphylococcus (G).
  • C12N15/31 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas.

PDF original: ES-2406359_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Ligandos de cromatografía estables en medio cáustico Campo de la invención La presente invención se refiere a ligandos de cromatografía que tienen estabilidad cáustica mejorada, por ejemplo, ligandos basados en proteínas de unión a inmunoglobulina tales como, proteína A Estafilocócica, así como a matrices de cromatografía que comprenden dichos ligandos.

Antecedentes

Los ligandos utilizados en cromatografía de afinidad normalmente confieren una alta selectividad por la molécula diana, dando por lo tanto como resultando una purificación económica, rápida y a alto rendimiento de las moléculas diana. Los reactivos y las matrices de cromatografía basados en proteína A estafilocócica (SpA) han encontrado un amplio uso en el campo de la cromatografía de afinidad para la captura y purificación de anticuerpos así como en los procedimientos de detección de anticuerpos debido a su capacidad para unirse a IgG sin afectar significativamente a la afinidad de la inmunoglobulina por el antígeno.

Por consiguiente, se han desarrollado diversos reactivos y medios que comprenden ligandos basados en proteína A y que se encuentran disponibles en el comercio, que incluyen, por ejemplo, ProSep®-vA High Capacity, ProSep® vA Ultra y ProSep® UltraPlus (Millipore) y Proteína A Sepharose™, MabSelect™, MabSelect Xtra™ y MabSelect SuRe® (GE Healthcare) y Poros Mab-Capture A™ (Applied Biosystems) .

Para conservar la selectividad y la capacidad de unión de los ligandos de cromatografía incluyendo, por ejemplo, resinas que incluyen ligandos de cromatografía basados en SpA, las resinas unidas al ligando, denominadas matrices de cromatografía, deben de limpiarse y normalmente se limpian en condiciones alcalinas, por ejemplo, sin hidróxido de sodio. Por ejemplo, un procedimiento convencional que se usa para la limpieza y renovación de la matriz es un protocolo alcalino de limpieza en el sitio (CIP, por las siglas Cleaning-In-Place) , que normalmente implica el tratamiento de la matriz con NaOH 1 M, pH 14. Sin embargo, frecuentemente dicho tratamiento riguroso no es deseable, especialmente, cuando el ligando es una proteína o una molécula basada en proteínas.

El documento US 2006/0134805 A1 desvela la purificación de inmunoglobulinas. El documento WO 03/080655 A1 desvela una proteína de unión a inmunoglobulina mutada. El documento EP 0550771 A1 desvela la proteína artificial que se combina con inmunoglobulina. El documento EP 0230869 A desvela la construcción de una proteína de unión a IgG para facilitar el procesamiento aguas abajo usando modificación de proteínas por ingeniería genética. El documento JP 2006304633 A desvela una proteína de unión a inmunoglobulina. El documento Eur. J. Blochem. 186, 557-561 (1989) desvela la inmovilización dirigida por tiol de receptores de unión a IgG recombinante. En Amersham Application Note 2004, Process-scale antibody purification” 2004, Amersham Biosciences, páginas 1 a 6 se desvelan estudios sobre “MabSelect SuRe sobre toxicidad, filtración, eliminación y saneamiento de ligandos.

El documento Protein Engineering, vol. 1, no. 2, páginas 107 a 113, 1987 desvela un dominio de unión a IgG sintético basado en la proteína A estafilocócica. El documento A. J. Chromatography B, 848 (2007) 40-47 desvela una cromatografía con la proteína A para la purificación de anticuerpos. El documento FEMS Immunology and Medical Microbiology 20 (1998) 69-78 desvela que todos los dominios individuales de la proteína A estafilocócica muestran unión a Fab. El documento WO 00/69457 A desvela dominios de unión basados en proteína A con actividades deseables. El documento WO 2008/039141 A desvela un ligando de cromatografía que comprende un dominio C de la proteína A de Staphyloccocus aureus para el aislamiento de anticuerpos.

Sumario de la invención La presente invención proporciona ligandos de cromatografía basados en SpA estables en medio alcalino que pueden, por ejemplo, resistir ciclos repetidos de limpieza en el sitio (CIP) . Más específicamente, los ligandos de acuerdo con la invención pueden soportar la limpieza en medio alcalino convencional durante un periodo de tiempo prolongado, lo que hace que los ligandos sean candidatos atractivos, especialmente para la purificación de inmunoglobulinas a gran escala y rentable.

En un aspecto de la presente invención, un ligando de cromatografía estable en medio alcalino comprende dos o más dominios de SpA. Por ejemplo, en algunas realizaciones de acuerdo con este aspecto, se proporciona un ligando de cromatografía estable en medio alcalino que comprende dos o más dominios B o dos o más dominios Z de la proteína A de Staphyloccocus (SpA) , o un fragmento funcional o una variante del mismo, en el que los dos o más dominios B o los dos o más dominios Z están unidos a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina.

En algunas realizaciones de acuerdo con este aspecto, el ligando comprende tres o más dominios B o tres o más dominios Z de SpA, o un fragmento funcional o una variante del mismo, en el que los tres o más dominios B o los tres o más dominios Z están unidos a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina. En algunas otras realizaciones, el ligando comprende cuatro o más dominios B o cuatro o más dominios Z de SpA, en el que los cuatro o más dominios B o los cuatro o más dominios Z están unidos a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina. En otras realizaciones más, el ligando comprende cinco o más dominios B o cinco o más dominios Z de SpA; o seis o más dominios B o seis o más dominios Z de SpA; o siete o más dominios B o siete o más dominios Z de SpA, en el que los cinco o más dominios B o los cinco o más dominios Z, o los seis o más dominios B, o los seis o más dominios Z, o los siete o más dominios B o los siete o más dominios Z están unidos a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina.

En otro aspecto de acuerdo con la presente invención, un ligando de cromatografía estable en medio alcalino comprende uno o más dominios aislados E, D, A, B, C o Z de la proteína A de Staphyloccocus, en el que el uno o más dominios aislados comprenden uno o más restos de aminoácidos mutados en la posición n+1 por cualquier

aminoácido de origen natural excepto cisteína (C) , serina (S) , alanina (A) , glicina (G) , asparagina (N) o glutamina (Q) . En algunas realizaciones, n representa el resto de asparagina en la posición 23 de un dominio de SpA aislado. En la Tabla I se muestran ligandos ejemplares que tienen una mutación en la posición 24 de un dominio de SpA aislado en el que n representa una asparagina.

Tabla I

Dominios SpA que incluyen modificaciones Denominación

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24M

sustituidos por metionina D-E24M

A-E24M

B-E24M

C-E24M

Z-E24M

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24I

sustituidos por isoleucina D-E24I

A-E24I

B-E24I

C-E24I

Z-E24I

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24F

sustituidos por fenilalanina D-E24F

A-E24F

B-E24F

C-E24F

Z-E24F

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24T

sustituidos por treonina D-E24T

A-E24T

B-E24T

C-E24T

Z-E24T

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24P

sustituidos por prolina D-E24P

A-E24P

B-E24P

C-E24P

Z-E24P

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24W

sustituidos por triptófano D-E24W

A-E24W

B-E24W

C-E24W

Z-E24W

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24R

sustituidos por arginina D-E24R

A-E24R

B -E24R

C-E24R

Z-E24R

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24V

sustituidos por valina D-E24V

A-E24V

B-E24V

C-E24V

Z-E24V

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24L

sustituidos por leucina D-E24L

A-E24L

B-E24L

C-E24L

Z-E24L

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24Y

sustituidos por tirosina D-E24Y

A-E24Y

B-E24Y

C-E24Y

Z-E24Y

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un ligando de cromatografía estable en medio alcalino que comprende dos o más dominios B o dos o más dominios Z de la proteína A de Staphylococcus (SpA) , en el que dominio B comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 10, y el dominio Z comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 12, en el que los dos o más dominios B o los dos o más dominios Z se unen a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina mediante una unión multipunto, y adicionalmente en el que el ligando conserva al menos el 95 % de su capacidad de unión después de 5 horas de incubación en NaOH 0, 5 M.

2. El ligando de cromatografía estable en medio alcalino de la reivindicación 1, en el que el ligando comprende tres o más dominios B o tres o más dominios Z de SpA; o en el que el ligando comprende cuatro o más dominios B o cuatro o más dominios Z de SpA; o en el que el ligando comprende cinco o más dominios B o cinco o más dominios Z de SpA; o en el que el ligando comprende seis o más dominios B o seis o más dominios Z de SpA; o en el que el ligando comprende siete o más dominios B o siete o más dominios Z de SpA.

3. El ligando de cromatografía estable en medio alcalino de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el ligando es capaz de unirse al menos 1, 5 veces, o 2 veces, o 3 veces o más a IgG en comparación con la SpA natural, después de una exposición a NaOH 0, 5 M durante al menos 5 horas.

4. El ligando de cromatografía de afinidad estable en medio alcalino de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende tres dominios B (B3) , o cuatro dominios B (B4) , o cinco dominios B (B5) , o seis dominios B (B6) o siete dominios B (B7) de la proteína A de Staphylococcus (SpA) unido a un soporte sólido mediante unión multipunto, en el que el grado de estabilidad cáustica del ligando está en el orden de B3 < B4 < B5 < B6 < B7, después de una exposición del ligando a NaOH 0, 5 M durante al menos 5 horas.

5. El ligando de cromatografía de afinidad estable en medio alcalino de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende tres dominios Z (Z3) , o cuatro dominios Z (Z4) , o cinco dominios Z (Z5) , o seis dominios Z (Z6) o siete dominios Z (Z7) de la proteína A de Staphylococcus (SpA) unido a un soporte sólido mediante unión multipunto, en el que el grado de estabilidad cáustica del ligando está en el orden de Z3 < Z4 < Z5 < Z6 < Z7, después de una exposición del ligando a NaOH 0, 5 M durante al menos 5 horas.

6. Una matriz de cromatografía que comprende un ligando de cromatografía de afinidad estable en medio alcalino de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

7. Una matriz de cromatografía de afinidad estable en medio alcalino que comprende un ligando de cromatografía de afinidad estable en medio alcalino de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende tres o más, o cuatro o más, o cinco o más, o seis o más, o siete o más dominios B o Z de la proteína A de Staphylococcus (SpA) unido a un soporte sólido mediante unión multipunto.

8. La matriz de cromatografía estable en medio alcalino de la reivindicación 7, en la que el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en vidrio de poros controlados, poli (alcohol vinílico) , óxido de circonio, agarosa, polimetacrilato, poliacrilato, poliacrilamida y poliestireno.

9. Un procedimiento de purificación por afinidad de una o más inmunoglobulinas procedentes de una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) proporcionar una muestra que comprenda una o más inmunoglobulinas;

(b) poner en contacto la muestra con la matriz de la reivindicación 6, 7 u 8 en condiciones tales que la una o más inmunoglobulinas se unan a la matriz; y

(c) recuperar la una o más inmunoglobulinas unidas eluyendo en condiciones adecuadas.

Figura 1 Secuencias de ADN de los dominios de unión a IgG naturales de la proteína A SEC ID Nº: l- Secuencia de ADN del dominio E

SEC ID Nº: 2- Secuencia de ADN del dominio D

SEC ID Nº: 3- Secuencia de ADN del dominio A

SEC ID Nº: 4 Secuencia de ADN del dominio B

SEC ID Nº: 5- Secuencia de ADN del dominio C

Figura 2

SEC ID Nº: 6- Secuencia de ADN del dominio Z

Figura 3

Alineamientos de las secuencias de los dominios de unión a IgG

Figura 4

SEC ID Nº: 12- Secuencia de aminoácidos del dominio Z

Figura 5

FIG. 6 Dominio B natural marcado con 6 histidinas (SEC ID Nº: 13)

E24M (SEC ID Nº: 14)

E24I (SEC ID Nº: 15)

E24F (SEC ID Nº: 16)

E24T (SEC ID Nº: 17)

E24P (SEC ID Nº: 18)

E24W (SEC ID Nº: 19)

E24R (SEC ID Nº: 20)

E24V (SEC ID Nº: 21)

E24L (SEC ID Nº: 22)

FIG. 6 Continuación E24Y (SEC ID Nº: 23)

E24H (SEC ID Nº: 24)

E24K fSEC ID Nº: 25)

E24D (SEC ID Nº: 26)

FIG.7

Dominio B natural marcado con 6 histidinas (SEC ID Nº: 27)

E24M (SEC ID Nº: 28)

E24I (SEC ID Nº: 29)

E24F (SEC ID Nº: 30)

E24T (SEC ID Nº: 31)

E24P (SEC ID Nº: 32)

E24W (SEC ID Nº: 33)

E24R (SEC ID Nº: 34)

FIG. 7 Continuación E24V (SEC ID Nº: 35)

E24L (SEC ID Nº: 36)

E24Y (SEC ID Nº: 37)

E24H (SEC ID Nº: 38)

E24K (SEC ID Nº: 39)

E24D (SEC ID Nº: 40)

Figura 8


 

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