LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS LIGANDOS AISLADOS, UNOS ADN QUE CODIFICAN PARA DICHOS LIGANDOS,

Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS FABRICADAS A PARTIR DE DICHOS LIGANDOS. SE PUEDEN USAR LOS LIGANDOS AISLADOS PARA REGULAR UNA RESPUESTA INMUNITARIA. SON TAMBIEN UTILES PARA CRIBAR LOS INHIBIDORES DE DICHA RESPUESTA INMUNITARIA.

Ligando para el activador del receptor de NF-kappa b, el ligando es miembro de la superfamilia de TNF.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere en general al campo de las citoquinas, y más específicamente a pares receptor/ligando de citoquina que tienen actividad inmunorreguladora.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

El funcionamiento eficiente del sistema inmunitario requiere un balance sutil entre la proliferación y diferenciación celular y la muerte celular, a fin de asegurar que el sistema inmunitario es capaz de reaccionar a los antígenos extraños, pero no a los propios. Integrales con el proceso de regulación de la respuesta inmunológica e inflamatoria son varios miembros de la superfamilia Receptor del Factor de Necrosis Tumoral (TNF) /Receptor del Factor del Crecimiento de los Nervios (Smith et al., Science 248: 1019; 1990) . Esta familia de receptores incluye dos receptores TNF diferentes (Tipo I y Tipo 11; Smith et al., supra; y Schall et al., Cel! 61: 361, 1990) , el receptor del factor de crecimiento de los nervios (Johnson et al., Cel! 47: 545, 1986) , el antígeno CD40 de las células B (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989) , CD27 (Camerini et al., J. Immunol. 147: 3165, 1991) , CD30 (Durkop et al., Cel! 68: 421, 1992) , el antígeno OX40 de las células T (Mallett et al., EMBO J. 9: 1063, 1990) , el antígeno humano Fas (Itoh et al., Cel! 66: 233, 1991) , el receptor murino 4-1 BB (Kwon et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 86: 1963, 1989) Y un receptor al que se hace referencia como Receptor Inductor de Apoptosis (AIR; USSN 08/720.864, presentada el 4 de octubre de 1996) .

CD40 es un receptor presente en los linfocitos B, las células epiteliales y algunas líneas de células de carcinoma que interacciona con un ligando encontrado en las células T activadas, CD40L (documento USSN 08/249.189, presentado el 24 de mayo de 1994) . La interacción de este par ligando/receptor es esencial para la respuesta inmunológica tanto celular como humoral. La transducción de señales por CD40 está mediada por la asociación del dominio citoplásmico de esta molécula con miembros de los factores asociados al receptor TNF (TRAFs; Baker y Reddy, Oncogene 12: 1, 1996) . Se ha encontrado recientemente que los ratones que son deficientes en la expresión de TRAF3 debido a una disrupción direccionada en el gen que codifica TRAF3 parecen normales al nacer pero desarrollan hipoglucemia progresiva y empobrecimiento en glóbulos blancos periféricos, y mueren al cabo de aproximadamente 10 días de edad (Xu et al., Immunity 5: 407, 1996) . Las respuestas inmunológicas de ratones quiméricos reconstituidos con células hepáticas fetales TRAF3-1-se asemejan a las de los ratones deficientes en CD40, aunque las células TRAF3-1-parecen ser funcionalmente normales.

El papel crítico de TRAF3 en la transducción de señales puede residir en su interacción con uno de los otros miembros de la superfamilia de receptores TNF, por ejemplo, CD30 o CD27, que están presentes en las células T. Alternativamente, pueden existir otros miembros, todavía no identificados, de esta familia de receptores que interaccionan con TRAF3 y juegan un papel importante en el desarrollo posnatal así como en el desarrollo de un sistema inmunitario competente. La identificación de miembros adicionales de la superfamilia de receptores TNF podría proporcionar un medio adicional de regulación de la respuesta inmunológica e inflamatoria, así como proporcionar potencialmente una mejor comprensión en cuanto al desarrollo post-natal de los mamíferos.

El documento WO 98/25958 describe una secuencia de aminoácidos murina a la que se hace referencia como 499E9 y un anticuerpo que es inmunorreactivo con la secuencia de aminoácidos murina 499E9.

SUMARIO DE LA INVENCiÓN

La presente invención proporciona una contraestructura, o ligando, para un nuevo receptor al que se hace referencia como RANK (para receptor activador de NF-KB) , que es un miembro de la superfamilia TNF. El ligando, al que se hace referencia como RANKL, es una proteína transmembranal de Tipo 2 con un dominio intracelular que tiene menos de aproximadamente 50 aminoácidos, un dominio transmembranal y un dominio extracelular de aproximadamente 240 a 250 aminoácidos. Análogamente a otros miembros de la familia TNF a la que pertenece, RANKL tiene una región 'espaciadora' entre el dominio transmembranal y el dominio de fijación de receptores que no es necesaria para la fijación de receptores. De acuerdo con ello, formas solubles de RANKL pueden comprender el dominio extracelular entero o fragmentos del mismo que incluyen la región de fijación de receptores.

RANK es una proteína transmembranal de Tipo I que tiene 616 residuos de aminoácidos, que es un miembro de la superfamilia TNFR, e interacciona con TRAF3. La excitación de RANK por sobre-expresión, co-expresión de RANK Y RANKL fijado a la membrana, o por RANKL soluble o anticuerpos agonistas de RANK, da como resultado la regulación creciente del factor de transcripción NF-KB, un factor de transcripción ubicuo que es utilizado de modo muy extenso en células del sistema inmunitario.

Estos y otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes después de considerar la descripción detallada que sigue de la invención.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 demuestra la influencia de RANK.Fc y hRANKL en el crecimiento de las células T activadas. Se cultivaron células T de sangre periférica humana como se describe en el Ejemplo 12; la recuperación de células T viables se determinó por conteos triplicados con azul tripán.

La Figura 2 ilustra la aptitud de RANKL para inducir la formación de aglomerados OC humanos. Células dendríticas (OC) funcionalmente maduras se generaron in vitro a partir de progenitores de médula ósea (BM) C034+, y se cultivaron como se describe en el Ejemplo 13. Se cultivaron OC C01 a+ en un cóctel de citoquinas aislado (Figura 2A) , en cóctel más C040L (Figura 2B) , RANKL (Figura 2C) , o RANKL desactivado por calentamiento (LlH) (Figura 20) , y se fotografiaron luego utilizando un microscopio de inversión.

La Figura 3 demuestra que RANKL aumenta la capacidad alo-estimuladora de OC. Se incubaron células T alogénicas con números variables de OC irradiadas, cultivadas como se describe en el Ejemplo 13. Los cultivos se pulsaron con [3H]-timidina y las células se cosecharon sobre hojas de fibra de vidrio para conteo. Los valores representan el valor medio ± la desviación estándar (SO) de cultivos triplicados.

La Figura 4 presenta una alineación de RANK humana con otros miembros de la familia TNFR en la región de pseudorrepeticiones extracelulares ricas en císteína, estructuralmente conservadas. Se indican los enlaces disulfuro predichos (OS1-0S3) . RANK y C040 contienen sustituciones idénticas de aminoácidos (CAH, CAG) que eliminan OS2 en la segunda pseudorrepetición.

La Figura 5 presenta una alineación de RANKL humana con otros miembros de la familia TNF.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

Una nueva inserción parcial de cONA con un marco de lectura abierto predicho que tiene cierta semejanza con C040 se identificó en una base de datos que contenía información de secuencias de cONAs generados a partir de células dendríticas (OC) derivadas de médula ósea humana. La inserción se utilizó para hibridación a transferencias de colonias generadas a partir de una genoteca de OC cONA que contenía cONAs de longitud total. Se analizaron varias hibridaciones de colonias, y se aislaron dos clones (SEQ ID NOs: 1 y 3) . SEQ ID NO:5 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de una proteína de longitud total predicha basada en alineación de las secuencias solapantes de SEQ ID NOs: 1 y 3.

RANK es un miembro de la superfamilia de receptores TNF; el mismo se asemeja estrechamente a C040 en la región extracelular. Análogamente a C040, RANK se asocia con TRAF2 y TRAF3 (como se ha determinado por ensayos de co-inmunoprecipitación sustancialmente como ha sido descrito por Rothe et al., Ce1/83: 1243, 1995. Los TRAFs son críticamente importantes en la regulación de la respuesta inmunológica e inflamatoria. Por su asociación con diversos miembros de la superfamilia de receptores TNF, se transduce una señal a una célula. Dicha señal da como resultado la proliferación, diferenciación o apoptosis de la célula, dependiendo del receptor o receptores que se exciten y del o de los TRAF (s) que se asocien con el o los receptores; diferentes... [Seguir leyendo]

1. Un ONA aislado seleccionado del grupo constituido por:

(a) un ONA que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 13, en donde la proteína tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre

el aminoácido 1 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y el aminoácido 317, inclusive;

(b) moléculas de ONA que codifican fragmentos de proteínas codificadas por el ONA de (a) que son capaces de fijar el polipéptido RANK; y

(c) un ONA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 1-951 de SEQ ID 10 NO:12;

(d) un ONA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 484 a 951 de SEQ ID NO:12; y

(e) un ONA que codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos entre el aminoácido 1 y el aminoácido 317 de SEQ ID NO:13.

15 2. El ONA aislado de la reivindicación 1, que codifica un polipéptido RANKL que es idéntico al menos aproximadamente en un 90% en secuencia de aminoácidos a RANKL tal como es codificado por el ONA de la reivindicación 1 (c) o la reivindicación 1 (e) .

3. El ONA aislado de la reivindicación 1 (a) , (b) o (d) que codifica un polipéptido RANKL soluble.

4. Un ONA aislado que codifica un RANKL soluble, seleccionado del grupo constituido por:

(a) un ONA que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 13, en donde la proteína tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 69 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y el aminoácido 317, inclusive; y

(b) moléculas de ONA que codifican fragmentos de proteínas codificadas por el ONA de (a) que son capaces de 25 fijar el polipéptido RANK.

5. El ONA aislado de la reivindicación 4, que comprende adicionalmente un ONA que codifica un polipéptido seleccionado del grupo constituido por un dominio de inmunoglobulina Fc, una muteína de inmunoglobulina Fc, una cremallera de leucina, y combinaciones de los mismos.

6. Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ONA de acuerdo con una cualquiera de 30 las reivindicaciones 1 a 5.

7. Una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación

6.

8. Un proceso para preparar una proteína RANKL, que comprende cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 7 en condiciones que promueven la expresión y recuperación de RANKL.

9. Un polipéptido RANKL aislado seleccionado del grupo constituido por:

(a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO:13, en donde el polipéptido tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 1 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y 317, inclusive;

(b) fragmentos del polipéptido de (a) que son capaces de fijar el polipéptido RANK; y

(c) un polipéptido RANKL codificado por un ONA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 1 a 951 de SEQ ID NO:12;

(d) un polipéptido RANKL codificado por un ONA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 484 a 951 de SEQ ID NO:12;

45 (e) un polipéptido RANKL constituido por la secuencia de aminoácidos entre el aminoácido 1 y el aminoácido 317 de SEQ ID NO:13.

10. La proteína de acuerdo con la reivindicación 9, que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos aproximadamente en un 90% al polipéptido de la reivindicación 9 (c) o la reivindicación 9 (e) .

11. La proteína de acuerdo con la reivindicación 9 (a) , (b) o (d) , que es una RANKL soluble.

12. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 9, 10 ó 11 que tiene una secuencia de aminoácidos diferente por tener una deleción, inserción o sustitución.

13. Una proteína RANKL soluble de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende adicionalmente un péptido

seleccionado del grupo constituido por un dominio de inmunoglobulina Fc, una muteína de inmunoglobulina Fc, una cremallera de leucina, y combinaciones de los mismos.

14. Un anticuerpo inmunorreactivo con el polipéptido RANKL de acuerdo con la reivindicación 9, que no es inmunorreactivo con el polipéptido que tiene la secuencia siguiente:

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15. Utilización de un polipéptido RANKL seleccionado de: 10

(a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO:13, en donde el polipéptido tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 1 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y 317, inclusive; y

(b) fragmentos del polipéptido de (a) que son capaces de fijar el polipéptido RANK, para cribado respecto a un inhibidor de la activación de NF-KB.

16. Una composición que comprende el polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, y un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.

17. Un kit para detectar RANK o RANKL solubles, o monitorizar la actividad relacionada con RANK, que comprende un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13.

18. Un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, para utilización en el cribado respecto a un inhibidor de RANK.

19. Un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, para utilización en el diseño basado en estructura de inhibidores de RANKL.

20. Utilización de un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13 en el desarrollo de anticuerpos para RANKL.

21. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14 para utilización en la inhibición de la fijación a RANK.

22. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14 para utilización en la interferencia con la señalización de RANKL.

23. Una composlclon que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14 para utilización en la inhibición de la fijación a RANK.

24. Un polipéptido RANKL soluble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13 para utilización como agonista de RANK.

25. La utilización de acuerdo con la reivindicación 24, en la cual el polipéptido induce actividad de NF-kappa B.

26. Una composición que comprende un polipéptido RANKL soluble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13 para utilización como un agonista de RANK.

27. Una composición de acuerdo con la reivindicación 26 para inducir la actividad de NF-kappa B.

28. Un método de preparación de un anticuerpo que comprende utilizar un polipéptido RANKL de acuerdo con la reivindicación 9 como inmunógeno.

29. Un método de preparación en un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende utilizar un polipéptido RANKL de acuerdo con la reivindicación 9 como inmunógeno.

30. Una composición que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14.

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