LACASA DE ALTO POTENCIAL REDOX FUNCIONAL EN SANGRE MEDIANTE EVOLUCIÓN DIRIGIDA MÉTODO DE OBTENCIÓN Y SUS APLICACIONES.

Lacasa de alto potencial redox funcional en sangre mediante evolución dirigida método de obtención y sus aplicaciones.

La presente invención describe una lacasa de alto potencial redox obtenida mediante evolución molecular dirigida que es activa en condiciones electrofisiológicas

, que resiste elevadas concentraciones de haluros, que tiene una actividad significativa a pHs neutros/alcalinos y que es activa en sangre y plasma humano. La presente invención se refiere a la secuencia aminoacídica de dicha lacasa, a la secuencia nucleotídica que codifica para dicha lacasa y células que permiten su obtención. La lacasa de la invención presenta aplicaciones en diversos sectores: nano-biotecnología, biomedicina, procesos de biorremediación, industria papelera y química fina.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201330222.

Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: ALCALDE GALEOTE,MIGUEL, PITA MARTINEZ,MARCOS, LOPEZ DE LACEY,ANTONIO, MATE MATE,Diana, GONZÁLEZ PÉREZ,David, LUDWIG,Roland, KITTL,Roman.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/53 (Oxidorreductasas (1))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/02 (Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa)

PDF original: ES-2525195_A1.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

LACASA DE ALTO POTENCIAL REDOX FUNCIONAL EN SANGRE MEDIANTE EVOLUCIÓN DIRIGIDA MÉTODO DE OBTENCIÓN Y SUS APLICACIONES ESTADO DE LA TÉCNICA

Debido a su extraordinaria versatilidad, el estudio de enzimas oxidorreductasas ligninolítícas secretadas por hongos de podredumbre blanca es de especial interés biotecnológico, especialmente, las lacasas de alto potencial redox, las peroxidasas y las enzimas suministradoras de peróxido de hidrógeno(Martinez, Ruiz-Duenas et al. 2009). Particularmente, las lacasas de alto potencial redox son consideradas por muchos como los biocatalizadores ecológicos del siglo XXI ya que oxidan fácilmente cientos de compuestos utilizando el oxígeno del aire y liberando agua como único subproducto (Mate, Garcia-Ruiz et al. 2011). No obstante, la ausencia de actividad catalítica a pHs neutros/básicos, junto con la inhibición por moderadas concentraciones de diferentes sustancias (haluros, iones metálicos, ácidos grasos, detergentes), siguen siendo un serio obstáculo para su explotación.

Lacasas de alto potencial redox (EC 1.10.3.2) activas bajo condiciones tan adversas son muy deseables para ser utilizadas en aplicaciones que abarcan desde la síntesis orgánica a la biorremediación (Gianfreda, Xu et al. 1999, Alcalde 2007). Además, esta clase de lacasas. pertenece al exclusivo grupo de oxidorreductasas capaces de aceptar electrones directamente desde el cátodo de una biopila de combustible o de un biosensor amperométrico. En efecto, el conjunto de ventajas que ofrecen las lacasas de alto potencial redox (p. ej. altas densidades de corriente, transferencia electrónica directa, bajo sobre potencial para la reducción del oxígeno y elevada estabilidad operacional) las sitúa entre los candidatos más adecuados para la construcción de dispositivos bioelectrónicos conteniendo enzimas inmovilizadas (Shleev and Ruzgas 2008).

Probablemente, uno de los desafíos más atractivos en este campo se centra en conseguir nanobiodispositivos inalámbricos implantables que trabajen en diferentes fluidos fisiológicos (sangre, saliva, lágrimas) con el fin de detectar y registrar la presencia de diversos metabolitos in vivo. Las principales deficiencias en la ingeniería de tales dispositivos provienen de las dificultades en la míniaturización de sus elementos individuales (antena, transductor), y en el diseño de enzimas fiables y estables para catalizar la reacción del biocátodo, en el cual el oxígeno disuelto en los fluidos se reduce a agua (Castillo, Gaspar et al. 2004, Bullen, Amot et al. 2006). Desafortunadamente, las lacasas de alto potencial redox son inactivas a pH sanguíneo (~7.4) y están fuertemente inhibidas por concentraciones de

cloruro muy inferiores a las presentes en la sangre (140-150 mM), lo que limita su aplicación específica en biodispositivos así como su utilización en otros procesos que tienen lugar a pH básico y/o en los que hay iones cloruro involucrados (p. ej. el procesamiento de material derivado de colorantes, el tratamiento de aguas residuales, la remediación de contaminantes, la síntesis de compuestos farmacéuticos o el procesamiento de alimentos)(Gianfreda, Xu et al. 1999, Alcalde 2007, Rodgers, Blanford et al. 2010).

En esta invención se presenta la primera lacasa de alto potencial redox funcional en fluidos fisiológicos, como la sangre humana. Dicha lacasa fue creada mediante evolución dirigida y tiene una extraordinaria resistencia a haluros y una actividad significativa a pHs neutros/alcalinos. Además, los beneficios de esta lacasa de alto potencial redox pueden ser extendidos a aplicaciones tales como ensayos biomédicos, procesos de biorremediación (p. ej. oxidación de pesticidas y de hidrocarburos aromáticos policíclicos o procesamiento de tintes y aguas residuales), bioblanqueo de pastas kraft y síntesis orgánica, entre otros procesos en los cuales los altos pHs y las elevadas concentraciones salinas presentes constituyen serios impedimentos (Alcalde, Ferrer et al. 2006, Rodríguez Couto and Toca Herrera 2006, Kunamneni, Camarero et a!. 2008, Witayakran and Ragauskas 2009).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Breve descripción Descripción detallada

La presente invención se basa en que los inventores han observado que es posible obtener lacasas termoestables funcionales en condiciones fisiológicas de pH neutro o ligeramente básicos y/o a altas concentraciones de iones haluros, como el ión cloruro, manteniendo un alto potencial redox, mediante la modificación o mutación en, al menos, un aminoácido clave de la lacasa original o parental de partida (lacasa mutante OB-1), más concretamente mediante la mutación F396I de dicha lacasa OB-1. Además, se describen otras mutaciones de esta lacasa en posiciones en la secuencia original OB-1 adicionales a la mutación F396I, ya sea de forma aislada o en combinación de varias ellas, y que es común a todas esta familia de lacasas.

La presente invención describe una lacasa de alto potencial redox de secuencia SEQ ID NO 10 (Ejemplo 1), que es activa a condiciones electrofisiológicas (Ejemplo 2.1) con gran resistencia a haluros (Ejemplo 2.2) y una actividad significativa a pHs neutros/alcalinos (Ejemplo 2.2) y que presenta actividad en sangre y plasma humano (Ejemplo 2.3). Igualmente, se describe la secuencia de nucleótidos codificante de la lacasa de la invención

(por ejemplo, la secuencia SEQ ID NO 9) así como construcciones genéticas necesarias para su producción.

El punto de partida fue la lacasa termoestable, lacasa OB-1, protegida por la patente 5 ES201030723 depositada el 17 de mayo de 2010, titulada Lacasa de alto potencial redox

(Maté et al., 2010). La lacasa OB-1 se sometió a cuatro ciclos de evolución dirigida en combinación con enfoques semi-racionales dio origen al último mutante de este proceso, la lacasa ChU-B de la invención de SEQ ID NO 10 (Ejemplo 1) cuyo sitio catalítico presenta unas características (Ejemplo 3) que lo convierten en una valiosa herramienta para diseñar 10 lacasas con un amplio espectro de aplicaciones biotecnológicas. Esta adaptación de las lacasas a condiciones muy diferentes a las determinadas por su naturaleza permite la catálisis en condiciones extremas y abre un extenso abanico de oportunidades para su utilización en nanobiodispositivos implantables, síntesis química y en procesos de detoxificación.

Un resumen de los polinucleótidos y péptidos descritos en la presente invención se resumen en Tabla 1.

VARIANTE

SECUENCIAS

NUCLEOTÍDICAS

VARIANTE

SECUENCIAS

AMINOACÍDICAS

SEQ ID N°

SEQ ID N°

OB-1

OB-1

35H10

35H10

20F1

20F1

27C7

27C7

ChU-B

ChU-B

14F1

14F1

1B1

1B1

3A7

3A7

19B12

19B12

18A10

18A10

21D9

21D9

17D4

17D4

20C3

20C3

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Reivindicaciones:

1.- Polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad lacasa activo a condiciones electrofisiológicas, en pHs neutros/alcalinos, resistente a elevadas concentraciones de haluros y/o que presenta actividad en sangre y plasma humano, caracterizado porque

la secuencia aminoacídica del polipéptido que codifica presenta una identidad de al menos un 50% con la SEQ ID NO: 2 (OB-1), y porque comprende al menos una alteración aminoacídica en la posición homologa a la posición 487 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido fenilalanina (F) original por el aminoácido isoleucina (I) (mutación F396I).

2.- Polinucléotido según la reivindicación 1, caracterizado por que su secuencia aminoacídica posee además una de las siguientes mutaciones adicionales o cualesquiera de sus combinaciones:

a) La sustitución del aminoácido serina (S) por el aminoácido arginina (R) en

la posición homologa a la posición 226 de SEQ ID NO 2 (S135R),

b) La sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) por e! aminoácido asparagina (N) en la posición homologa a la posición 296 de SEQ ID NO 2

(D205N),

c) La sustitución del aminoácido treonina (T) por el aminoácido valina (V) en

la posición homóloga a la posición 309 de SEQ ID NO 2 (T218V),

d) La deleción del aminoácido alanina (A) en la posición homóloga a la posición 480 de SEQ ID NO 2 (A389-),

e) La sustitución del aminoácido asparagina (N) por el aminoácido ácido aspártico (D) en la posición homóloga a la posición 517 de SEQ ID NO 2

(N426D),

f) La sustitución del aminoácido isoleucina (I) por el aminoácido valina (V) en la posición homóloga a la posición 543 de SEQ ID NO 2 (I452V),

g) La sustitución del aminoácido fenilalanina (F) por un aminoácido que se escoge de entre los siguientes: serina (S), prolina (P), treonina (T), alanina

(A), glicina (G), arginina (R) o glutámico (E), en la posición homóloga a la

posición 545 de SEQ ID NO 2 (F454S, F454P, F454T, F454A, F454G, F454R, F454E, respectivamente), y

h) La sustitución del aminoácido treonina (T) por el aminoácido serina (S) en la posición homóloga a la posición 578 de SEQ ID NO 2 (T487S).

3.* Polinucleótido según la reivindicación 1 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la SEQ ID NO 3.

4.- Polinucleótido según las reivindicaciones 1 y 3 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 5.

5.- Polinucleótido según las reivindicaciones 1 y 3 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 7.

6.- Polinucleótido según las reivindicaciones 1 y 3 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 9.

7.- Polinucleótido según las reivindicaciones 1 y 3 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 11.

8.- Polinucleótido según las reivindicaciones 1 y 3 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 13.

9 - Polinucleótido según las reivindicaciones 1 y 3 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 15.

10.- Polinucleótido según las reivindicaciones 1 y 3 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 17.

11.- Polinucleótido según las reivindicaciones 1 y 3 caracterizado por que su

secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 19.

12.- Polinucleótido según las reivindicaciones 1 y 3 caracterizado por que su

secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 21.

13.- Polinucleótido según las reivindicaciones 1 y 3 caracterizado por que su

secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 23.

14.- Polinucleótido según las reivindicaciones 1 y 3 caracterizado por que su

secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 25.

15.- Polinucleótido según las reivindicaciones 1 y 3 caracterizado por que su

secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 27.

16.- Polipéptido con actividad lacasa activa en condiciones electrofisiológicas, en pHs neutros/alcaiinos, resistente a elevadas concentraciones de haluros y/o activa en sangre y plasma humano caracterizado por que es codificado por alguna de las secuencias nucleotídicas según las reivindicaciones 1 a 15.

17.- Polipéptido según la reivindicación 16 caracterizado por que su secuencia se corresponde con alguna de las siguientes: SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28.

18.- Polipéptido según la reivindicación 16 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 10.

19.- Método de obtención del polipéptido según las reivindicaciónes 16 a la 18 caracterizado por comprender las sigientes etapas:

a. Introducir un vector con el polinucléotido según una de las reivindicaciones 1 a la 15 en una célula hospedadora adecuada,

b. Cultivar la célula hospedadora en un medio adecuado, y,

c. Purificar el polipéptido con actividad lacasa.

20.- Célula hospedadora caracterizada por que comprende el polinucléotido según las reivindicaciones 1 a la 15 y es capaz de producir el polipéptido según las reivindicaciones 16 a la 18.

21.- La célula hospedadora según la reivindicación 20 caracterizada por ser una levadura.

22.- La célula hospedadora según la reivindicación 21 caracterizada por pertenecer al género Saccharomyces sp. o Pichia sp, particularmente, las especies Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris.

23 - El uso de la célula hospedadora según las reivindicaciones 20 a la 22 en procesos de biorremediación y degradación de residuos.

24.- Uso del polipéptido según las reivindicaciones 16 a 18 en procesos de biorremediación.

25.- Uso del polipéptido según las reivindicaciones 16 a 18 en procesos de bioblanqueo de pastas kraft.

26.- Uso dei polipéptido según las reivindicaciones 16 a 18 en síntesis orgánica.

27.- Kit de diagnóstico biomédico para la detección de metaboíitos y medición de su concentración en diferentes muestras biológicas caracterizado por que comprende un polipéptido según las reivindicaciones 16 a 18.

28.- Uso del polipéptido según las reivindicaciones 16 a 18 en la elaboración de dispositivos bioelectrónicos que contienen enzimas inmovilizadas.

29 - Dispositivo biolectrónico según la reivindicación 28 caracterizado por que 15 comprende el polipéptido según las reivindicaciones 16 a 18.

- Uso del dispositivo bioelectrónico según la reivindicación 29 para la elaboración de una composición farmacéutica de diagnóstico biomédico ¡n vivo.


 

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