Método y kits de purificación.

Un método para separar ácido nucleico de una muestra líquida, comprendiendo dicho método los pasos de aplicar una muestra líquida que contiene o se sospecha que contiene dicho ácido nucleico a una sección de recepción de la muestra de una membrana absorbente que no lleva agente de fijación específico alguno para ácidos nucleicos, hacer que dicha muestra líquida fluya a lo largo de la membrana absorbente, de tal manera que el ácido nucleico se distribuya por toda la longitud de la membrana y, después de ello, detectar el ácido nucleico depositado sobre o recuperar el ácido nucleico de una región de dicha membrana que está separada de la sección de recepción de la muestra.

Método y kits de purificación.

La presente invención se refiere a un nuevo método de purificación, que puede utilizarse en una gran diversidad de 5 ensayos, así como a reactivos y kits útiles en dicho método.

Una gran diversidad de métodos de ensayo se utiliza en diagnósticos o detección. La detección de analitos tales como proteínas sobre una diversidad de soportes sólidos es bien conocida en la técnica. Muchos de tales ensayos se encuentran en forma de ensayos de "varilla de nivel" que están basados en el flujo lateral de una muestra líquida 10 que contiene el analito a lo largo de una membrana, donde los mismos encuentran etiquetas, parejas de fijación etiquetadas y/o parejas de fijación inmovilizadas, en una secuencia por la cual se revela sobre la membrana una señal detectable visible. Tales métodos son ventajosos en el sentido de que proporcionan resultados rápidos, y pueden ser utilizados por operadores inexpertos prácticamente en cualquier lugar.

Por ejemplo, los mismos pueden ser utilizados en agricultura para detectar plagas o patógenos particulares en plantas de cosecha, tales como antígenos fúngicos o infecciones virales.

En ciertas situaciones, un resultado simple positivo o negativo, indicativo de la presencia o ausencia de analito, es todo lo que se necesita. Por ejemplo, tales ensayos se utilizan comúnmente en tests de gestación, y la mera 20 presencia de una hormona específica, tal como HCG, es indicativa de que el sujeto está gestante.

Sin embargo, en muchas circunstancias, un test de este tipo puede proporcionar sólo una diagnosis preliminar de un posible problema o condición. En el caso de muchos microorganismos, por ejemplo, la presencia de una proteína particular puede ser indicativa de la presencia de un tipo de organismo particular, tal como la clase general 25 bacteriana, fúngica o viral que está presente, pero la cepa precisa del organismo puede no ser detectable de esta manera. Dado que la cepa precisa es frecuentemente crítica en la determinación del nivel exacto de riesgo de cualquier escenario particular, se requieren investigaciones adicionales. Por ejemplo, pueden existir muchas cepas de una bacteria particular tal como E. Coli o virus tales como virus de la gripe, pero sólo cepas particulares tales como E. coli 0157 o la cepa H5N1 de la gripe aviar que presentan un riesgo importante para la salud. La diagnosis 30 precisa de estas cepas puede ser difícil, dado que los anticuerpos utilizados en las técnicas de diagnóstico pueden interaccionar o reaccionar cruzadamente con proteínas de diversas cepas.

Métodos alternativos de detección o diagnosis actúan al nivel del ácido nucleico. En estos métodos, secuencias particulares de ácido nucleico, tales como secuencias de DNA o RNA se detectan en las muestras, y esto indica la 35 presencia de organismos particulares. Estas técnicas son muy sensibles, y por selección de ácidos nucleicos diana característicos adecuados, pueden detectarse cepas precisas o incluso formas alélicas o genómicas precisas de genes particulares, que pueden ser características de enfermedad genómica o predisposición para ciertos estados de enfermedad.

Las técnicas de amplificación tales como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) o reacción en cadena de 40 polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) significan que estas técnicas pueden emplearse incluso cuando la cantidad de ácido nucleico presente o probablemente presente en un ensayo es de hecho muy baja.

Así, estas técnicas son una herramienta poderosa en el área de la detección y la diagnosis.

Sin embargo, estas técnicas requieren por lo general ciertos métodos importantes de preparación de la muestra. Frecuentemente es necesario realizar una cantidad importante de purificación o preparación de muestras tales como 5 extractos brutos de tejidos tales como tejido vegetal o animal, o muestras de sangre u orina, a fin de eliminar restos en la muestra que podrían inhibir el método de detección del ácido nucleico, o enmascarar los resultados. Como consecuencia, con frecuencia es difícil realizar estos tests fuera de un ambiente de laboratorio, y por consiguiente las muestras tomadas tienen que ser transportadas para análisis ulterior.

El transporte de muestras líquidas que contienen material genético puede ser difícil, requiriendo esterilidad de la recogida de tales muestras, y/o congelación de las muestras. El almacenamiento temporal de muestras que contienen material genético tales como sangre, secadas sobre ácidos nucleicos en soportes sólidos, y en particular membranas tales como papeles de filtro y análogos es conocido. Sin embargo, se percibe generalmente que pueden presentarse problemas con la estabilidad de dicho material almacenado, habiéndose sugerido métodos para mejorar 15 esto, que implican impregnación del soporte sólido con diversos reactivos químicos, que incluyen bases débiles y agentes quelantes (véase por ejemplo la patente U.S. No. 5.756.126) .

Tarjetas de almacenamiento que pretenden realizar ciertos pasos preliminares de preparación de la muestra, tales como lisis celular y desnaturalización de proteínas, así como añadir potencialmente reactivos tales como cebadores 20 de PCR que pueden utilizarse en análisis subsiguiente, se describen también en la patente US No. 5.756.126, y están disponibles de Whatman como tarjetas FTA. Éstas llevan reactivos específicos tales como agentes quelantes, bases y detergentes iónicos para facilitar la capacidad de almacenamiento.

Se han realizado intentos que permiten la detección de ácidos nucleicos directamente sobre membranas, utilizando 25 dispositivos y sistemas complejos que emplean agentes de fijación para ácidos nucleicos específicos, haptenos y/o restos etiquetados que generan una señal, de modo análogo a lo encontrado con un analito proteínico convencional (véase por ejemplo WO 00/29.112 y Dinerva et al., J. of Clin. Microbiol. (2005) p 4015-4021) . En estos casos, es generalmente necesaria una amplificación, utilizando por ejemplo una reacción en cadena de polimerasa a fin de obtener cantidad suficiente del DNA diana presente en la muestra para proporcionar una señal detectable. 30

Los solicitantes han encontrado, sin embargo, que un dispositivo de flujo lateral convencional de líquido, como el utilizado por ejemplo en un inmunoensayo de tipo varilla de nivel puede proporcionar un medio excelente de purificación y almacenamiento de ácidos nucleicos, listo para análisis subsiguiente.

Conforme a la presente invención, se proporciona un método para separación de ácido nucleico de una muestra líquida, comprendiendo dicho método los pasos de aplicar una muestra líquida que contiene o se sospecha que contiene dicho ácido nucleico a una sección de recepción de la muestra de una de membrana absorbente que no lleva ningún agente de fijación específico para ácidos nucleicos, hacer que dicha muestra líquida fluya a lo largo de la membrana absorbente, a fin de que el ácido nucleico se distribuye en toda la longitud de la membrana y, después 40 de ello, detectar el ácido nucleico o recuperar el ácido nucleico de una región de dicha membrana que está separada de la sección de recepción de la muestra.

Los solicitantes han encontrado que, cuando se deja fluir a lo largo de una membrana absorbente, incluso en el tipo de condiciones utilizadas en un dispositivo de flujo de líquido, los ácidos nucleicos se fijan a las membranas, en particular las membranas de celulosa o nitrocelulosa, utilizadas en estos dispositivos. Parece ser que al dejar que una muestra líquida fluya a lo largo de una membrana absorbente, cualesquiera ácidos nucleicos presentes quedan 5 retenidos preferentemente en la membrana y así pueden separarse de otros componentes en la muestra. En estas circunstancias, aquéllos se distribuyen en toda la longitud de la membrana, en particular a lo largo de sustancialmente la totalidad y convenientemente toda la longitud de la membrana, en una forma en la que los mismos son estables. No hay necesidad alguna de proporcionar agentes de fijación específicos en la membrana para asegurar que los ácidos nucleicos quedan retenidos o concentrados en un área particular o prevenir la elución 10 completa de la membrana. Esto hace que el dispositivo sea más sencillo y más económico de producir. La presencia de ácidos nucleicos en la membrana puede detectarse utilizando cualquiera de los métodos de detección convencionales.

La presencia de ácido nucleico en la membrana puede detectarse subsiguientemente o el ácido nucleico puede 15 recuperarse subsiguientemente de dicha membrana, sea antes o después que las membranas se han dejado secar.

Como resultado, estas membranas proporcionan... [Seguir leyendo]

1. Un método para separar ácido nucleico de una muestra líquida, comprendiendo dicho método los pasos de aplicar una muestra líquida que contiene o se sospecha que contiene dicho ácido nucleico a una sección de recepción de la muestra de una membrana absorbente que no lleva agente de fijación específico alguno para ácidos nucleicos, hacer que dicha muestra líquida fluya a lo largo de la membrana absorbente, de tal manera que el ácido 5 nucleico se distribuya por toda la longitud de la membrana y, después de ello, detectar el ácido nucleico depositado sobre o recuperar el ácido nucleico de una región de dicha membrana que está separada de la sección de recepción de la muestra.

2. Un método conforme a la reivindicación 1, en el cual la membrana se seca o se deja secar después que el 10 líquido ha fluido a lo largo de la misma, antes de dicha detección o recuperación de ácido nucleico.

3. Un método conforme a la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el cual el ácido nucleico separado se somete a análisis ulterior.

4. Un método conforme a la reivindicación 3, en el cual el análisis ulterior se realiza utilizando una muestra de la membrana.

5. Un método conforme a la reivindicación 3, en el cual el ácido nucleico se eluye de la membrana antes de dicho análisis ulterior. 20

6. Un método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la membrana se procesa a fin de mejorar el empapamiento rápido del líquido a lo largo de la misma.

7. Un método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la muestra se 25 selecciona de una muestra fisiológica o clínica o un extracto de tejido, un extracto de tejido de planta o animal, sangre, suero, orina, leche, saliva, un extracto fecal, una muestra del medio ambiente; o una muestra de agua o un extracto de suelo.

8. Un método conforme a la reivindicación 1, que se utiliza en un ensayo para detectar la presencia de un 30 ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo dicho método los pasos de hacer que una muestra líquida que se sospecha contiene dicho ácido nucleico fluya a lo largo de la membrana de un dispositivo de flujo de líquido, y detectar la presencia de un ácido nucleico específico en una región de dicha membrana que está separada de la sección de recepción de la muestra.

9. Un método conforme a la reivindicación 8, en el cual el ácido nucleico se detecta utilizando una reacción de amplificación de ácido nucleico.

10. Un método conforme a la reivindicación 9, en el cual la reacción de amplificación de ácido nucleico es una reacción en cadena de polimerasa. 40

11. Un método conforme a la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el cual un reactivo útil en dicha reacción de amplificación de ácido nucleico está presente en la membrana después que la muestra ha fluido a lo largo de la misma.

12. Un método conforme a la reivindicación 11, en el cual el reactivo útil en dicha reacción de amplificación de 5 ácido nucleico es un cebador de amplificación.

13. Un método conforme a la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el cual dicho reactivo está presente en la membrana antes de la aplicación de la muestra.

14. Un método conforme a la reivindicación 13, en el cual dicho reactivo está presente en una sección de recepción de la muestra de la membrana y se transfiere a lo largo de la membrana en conjunción con la muestra.

15. Un método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la membrana forma parte de un dispositivo de flujo de líquido que está dispuesto para realizar un ensayo para un analito adicional. 15

16. Un método conforme a la reivindicación 15, en el cual el ensayo es un inmunoensayo.

17. Un ensayo de dos etapas para detectar la presencia de un analito y un ácido nucleico en una muestra líquida, comprendiendo dicho método los pasos de (i) hacer que una muestra líquida que se sospecha contiene 20 dicho analito y ácido nucleico fluya a lo largo de la membrana de un dispositivo de flujo de líquido capaz de conducir un ensayo para detectar la presencia de dicho analito, en el que la membrana no lleva agente alguno de fijación específica para ácidos nucleicos de tal manera que el ácido nucleico se distribuye en toda la longitud de la membrana y, (i i) detectar la presencia en la membrana de dicho ácido nucleico en una región de dicha membrana que está separada de una sección de recepción de la muestra del dispositivo de flujo de líquido. 25

18. Un ensayo conforme a la reivindicación 17, en el cual el ensayo del paso (i) es un inmunoensayo.

19. Un ensayo conforme a la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en el cual dichos analito y ácido nucleico se derivan del mismo organismo, o en el cual uno del analito o ácido nucleico es característico de un organismo 30 infeccioso particular, y el otro es característico de un hospedador de dicho organismo, o en el cual el analito es un pesticida aplicable a una planta y el ácido nucleico se encuentra en un gen de la planta.

20. Un kit para realizar un ensayo conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, que comprende una membrana absorbente que no lleva agente de fijación específico alguno para ácidos nucleicos; un reactivo útil 35 en una reacción de amplificación de ácido nucleico presente en la membrana antes de la aplicación de una muestra, y en el cual la membrana absorbente es un elemento de un dispositivo de flujo de líquido, en que el dispositivo de flujo de líquido está configurado para realizar un inmunoensayo para detectar un polipéptido.

21. Un kit conforme a la reivindicación 20, en el cual el reactivo es un cebador para uso en la amplificación de 40 una secuencia de ácido nucleico diana.

22. Un kit conforme a la reivindicación 20 o la reivindicación 21, en el cual dicho reactivo está posicionado a lo largo de la longitud de la membrana.

23. Un kit conforme a la reivindicación 20 o la reivindicación 21, en el cual el reactivo está presente en una sección de recepción de la muestra de la membrana, y es transferible a lo largo de la membrana en conjunción con 5 la muestra.