Método y kit para la preparación de una muestra para su uso en amplificación de ácido nucleico.

Método para la preparación de una muestra para su uso en amplificación de acido nucleico

, que va a usarse para la amplificación de acido nucleico en una muestra biológica, metodo que comprende:

una etapa de extracción en la que se at-jade un reactivo de extracción de acido nucleico a la muestra biológica para obtener un extracto de acido nucleico, y

una etapa de purificación en la que el extracto de acido nucleico se pone en contacto con zeolita para eliminar del extracto de acido nucleico sustancias que inhiben la amplificación de acido nucleico y se adsorben sobre la zeolita para obtener una muestra de amplificación de acido nucleico en el que la muestra biológica es sangre, liquido cefalorraquideo, orina, heces, esputo, saliva, descarga nasal o fluido tornado con torundas y

en el que el reactivo de extracción de acido nucleico contiene un tensioactivo y/o un alcali y en el que la zeolita es una zeolita protonada, y tiene una estructura cristalina de mordenita.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2008/070089.

Solicitante: EIKEN KAGAKU KABUSHIKI KAISHA.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 4-19-9, TAITO, TAITO-KU TOKYO 110-8408 JAPON.

Inventor/es: Notomi,Tsugunori, Mori,Yasuyoshi, SHINDOME,TSUYOSHI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

PDF original: ES-2528483_T3.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Método y kit para la preparación de una muestra para su uso en amplificación de ácido nucleico Campo técnico

La presente invención se refiere a un método y a un kit para la preparación de una muestra para su uso en amplificación de ácido nucleico.

Antecedentes de la técnica

Las técnicas de amplificación de ácido nucleico, incluyendo métodos de PCR y LAMP, han llegado a usarse en muchos campos de la biología tales como biología molecular y medicina, y se usan comúnmente para la obtención del perfil de ADN, pruebas alimentarias, pruebas de saneamiento medioambiental y pruebas con animales y plantas.

Cuando la muestra de prueba es un líquido puede usarse directamente como muestra de amplificación de ácido nucleico para la amplificación del ácido nucleico diana, pero puesto que el ácido nucleico diana está presente en células en el caso de una muestra biológica, la muestra biológica debe disolverse usando un lisado celular (por ejemplo, una disolución de álcali o tensioactivo) y eluirse el ácido nucleico de las células para preparar la muestra de amplificación de ácido nucleico.

Por ejemplo, puede añadirse una disolución que contiene dodecilsulfato de sodio a la muestra biológica y calentarse la mezcla para desnaturalizar la proteína, o añadirse una disolución acuosa de hidróxido de sodio a la misma, para romper las membranas celulares y eluir el ácido nucleico para su uso como muestra de amplificación de ácido nucleico.

Los esputos y la saliva son muestras biológicas muy importantes para el diagnóstico de enfermedad pulmonar tal como tuberculosis.

Sin embargo, habitualmente es difícil amplificar de manera estable ácido nucleico a partir de esputo o saliva, y por tanto la detección de Mycobacterium en esputo o saliva para su diagnóstico se logra habitualmente licuando el esputo o la saliva muestreados con hidróxido de sodio o similar y realizando separación centrífuga, recogiendo las células de Mycobacterium como precipitado y cultivándolas (documento de patente 1).

Cuando se prepara una muestra de amplificación de ácido nucleico a partir de una muestra biológica distinta de esputo o saliva, sustancias tales como proteínas, polisacáridos y lípidos que se eluyen con el ácido nucleico de las células inhiben parcial o completamente la reacción de amplificación de ácido nucleico, y por tanto se obtienen resultados no reproducibles o la presencia o el nivel de expresión del ácido nucleico diana no puede evaluarse de manera precisa.

Además, el tensioactivo usado en la preparación de la muestra de amplificación de ácido nucleico a partir de la muestra biológica puede inhibir parcial o completamente la reacción de amplificación de ácido nucleico si está presente por encima de una determinada concentración en la muestra de amplificación de ácido nucleico, y por tanto la muestra de amplificación de ácido nucleico debe diluirse para la reacción de amplificación de ácido nucleico.

Por estos motivos ha sido muy difícil realizar el diagnóstico de pacientes mediante la amplificación de ácido nucleico diana y hacer pruebas precisas para alimentos o saneamiento medioambiental, o de animales o plantas.

[Documento de patente 1] Publicación de patente japonesa no examinada HEI n.° 9-17365

Descripción de la invención

Problemas que van a solucionarse mediante la invención

Un objeto de la presente invención es eliminar sustancias en muestras biológicas y extractos de ácido nucleico que puedan inhibir la amplificación de ácido nucleico, y permitir una evaluación conveniente y precisa de la presencia de ácido nucleico diana o el nivel de expresión de un gen diana en una muestra biológica, mediante medios de amplificación de ácido nucleico que emplean una enzima.

Medios para solucionar los problemas

Con el fin de lograr el objeto establecido anteriormente, se proporciona un método para la preparación de una muestra para su uso en la amplificación de ácido nucleico, que va a usarse para la amplificación de ácido nucleico en una muestra biológica, método que comprende una etapa de extracción en la que se añade un reactivo de extracción de ácido nucleico a la muestra biológica para obtener un extracto de ácido nucleico, y una etapa de purificación en la que el extracto de ácido nucleico se pone en contacto con zeolita para obtener una muestra de amplificación de ácido nucleico adecuada para la amplificación de ácido nucleico, que permite la detección de ácido nucleico a alta sensibilidad.

El término zeolita se refiere colectivamente a sales de ácido aluminosilícico con microporos en sus cristales, y éstas tienen un esqueleto básico que es una estructura de red tridimensional de tetrahedros de SÍO4 y AIO4 enlazados por átomos de oxígeno compartidos. La zeolita contiene cationes tales como iones de metales alcalinos, iones de metales alcalinotérreos, iones amonio o iones hidrógeno en los cristales, y zeolita protonada es zeolita que contiene iones hidrógeno en los cristales. La zeolita con una estructura cristalina de mordenita es zeolita que tiene una estructura cristalina que refleja una estructura esquelética en columna hexagonal. La zeolita es preferiblemente zeolita con una razón S/A (razón de abundancia de silicio/aluminio) de 2 o más, y más preferiblemente zeolita con una razón S/A de 39 o más.

Los presentes inventores han encontrado que sustancias que inhiben la amplificación de ácido nucleico en muestras biológicas y extractos de ácido nucleico se adsorben eficazmente en la zeolita, pero que el propio ácido nucleico diana que va a usarse como molde para la reacción de amplificación de ácido nucleico no se adsorbe en la zeolita. El término adsorbido significa que la sustancia se incorpora uniéndose sobre la superficie de la zeolita o en sus microporos.

Puesto que el método de preparación descrito anteriormente permite que sustancias que inhiben la amplificación de ácido nucleico, que están presentes en una muestra biológica o extracto de ácido nucleico, se eliminen de la muestra de amplificación de ácido nucleico, es posible preparar una muestra de amplificación de ácido nucleico que permite la detección reproducible de ácido nucleico diana incluso a partir de muestras biológicas que normalmente no permiten una fácil amplificación de ácido nucleico.

El reactivo de extracción de ácido nucleico es preferiblemente uno que comprende un tensioactivo y/o álcali, en el que el tensioactivo es más preferiblemente un tensioactivo aniónico.

El tensioactivo aniónico es preferiblemente al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en sales de ácido aiquilsulfúrico, sales de ácido alquiletersuifúrico y sales de ácido alquilbencenosulfúrico, prefiriéndose más dodecilsulfato de sodio.

Sales de ácido aiquilsulfúrico, sales de ácido alquiletersuifúrico y sales de ácido alquilbencenosulfúrico como tensioactivos aniónicos pueden aumentar la eficacia de extracción de ácido nucleico a partir de muestras biológicas, permitiendo por tanto una eliminación eficaz de muestras de amplificación de ácido nucleico usando zeolita.

La etapa de extracción es preferiblemente una etapa en la que se añade un reactivo de extracción de ácido nucleico a la muestra biológica, con la adición de una sal inorgánica, para obtener un extracto de ácido nucleico.

La etapa de purificación es preferiblemente una etapa en la que se añade zeolita al extracto de ácido nucleico y se mezcla, y entonces se aísla la zeolita mediante separación centrífuga o filtración para obtener la muestra de amplificación de ácido nucleico.

La etapa de purificación también es preferiblemente una etapa en la que el extracto... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1.

Método para la preparación de una muestra para su uso en amplificación de ácido nucleico, que va a usarse para la amplificación de ácido nucleico en una muestra biológica, método que comprende:

una etapa de extracción en la que se añade un reactivo de extracción de ácido nucleico a la muestra biológica para obtener un extracto de ácido nucleico, y

una etapa de purificación en la que el extracto de ácido nucleico se pone en contacto con zeolita para eliminar del extracto de ácido nucleico sustancias que inhiben la amplificación de ácido nucleico y se adsorben sobre la zeolita para obtener una muestra de amplificación de ácido nucleico

en el que la muestra biológica es sangre, líquido cefalorraquídeo, orina, heces, esputo, saliva, descarga nasal o fluido tomado con torundas y

en el que el reactivo de extracción de ácido nucleico contiene un tensioactivo y/o un álcali y en el que la zeolita es una zeolita protonada, y tiene una estructura cristalina de mordenlta.

2.

Método según la reivindicación 1, en el que el tensioactivo es un tensioactivo aniónico.

3.

Método según la reivindicación 2, en el que el tensioactivo aniónico es al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en sales de ácido alqullsulfúrico, sales de ácido alqulletersulfúrico y sales de ácido alquilbencenosulfúrico; o en el que el tensioactivo aniónico es dodecilsulfato de sodio.

4.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa de extracción es una etapa en la que se añade un reactivo de extracción de ácido nucleico a la muestra biológica, con la adición de una sal inorgánica, para obtener un extracto de ácido nucleico.

5.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa de purificación es una etapa en la que se añade zeolita al extracto de ácido nucleico y se mezcla, y entonces se aísla la zeolita mediante separación centrífuga o filtración para obtener la muestra de amplificación de ácido nucleico; o en el que la etapa de purificación es una etapa en la que el extracto de ácido nucleico se hace pasar a través de una columna de eliminación empaquetada con zeolita para eliminar las sustancias que se adsorben sobre la

zeolita, para obtener una muestra de amplificación de ácido nucleico.

6.

Kit para la preparación de una muestra para su uso en amplificación de ácido nucleico, que va a usarse en el método de preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo el kit un reactivo de extracción de ácido nucleico y zeolita, en el que la zeolita está protonada y tiene una estructura cristalina de mordenita.

7.

Kit de preparación según la reivindicación 6, en el que el reactivo de extracción de ácido nucleico contiene un tensioactivo y/o un álcali.

8.

Kit de preparación según la reivindicación 7, en el que el tensioactivo es un tensioactivo aniónico.

9.

Kit para la detección de la amplificación de ácido nucleico, que comprende un kit de preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

1.

Kit para la detección de la amplificación de ácido nucleico, en el que todos o una parte de los reactivos en el kit para la detección de la amplificación de ácido nucleico según la reivindicación 9 son reactivos secos.