KIT PARA MEDIR EN FORMA SECUENCIAL (1) LA FRACCIÓN ENZIMÁTICAMENTE ACTIVA Y (2) LA CANTIDAD TOTAL DE UNA ENZIMA.

Un kit que comprende medios y herramientas para realizar una "extracción inmunitaria específica seguida de una detección enzimática" (SIEFED) y un "ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas" (ELISA) secuenciales para medir el estado de activación de una enzima (1) o células que puedan liberar la enzima en una muestra biológica obtenida de un mamífero,

o medir los efectos de compuestos sintetizados o naturales en dicha enzima y que comprende:

- un anticuerpo primario (2) o porción hipervariable del mismo, ambos específicos para la enzima (1) y unidos a una superficie de apoyo sólido (3),

- un sustrato adecuado para que la enzima lo transforme en un producto de reacción visible y

- un anticuerpo secundario (4) o una porción hipervariable del mismo, ambos específicos para dicha enzima, en el que el primer y el segundo anticuerpo no presentan reacción cruzada entre sí,

- reactivos adecuados para detectar un complejo anticuerpo primario (2)-enzima (1)-anticuerpo secundario (4), fijado en el apoyo sólido (3),

- una muestra de la enzima (1) pura con una determinada actividad enzimática y una determinada cantidad total que se utilizará para establecer las curvas de referencia del procedimiento SIEFED y ELISA;

- caracterizado porque solamente hay una superficie de apoyo sólido (3) presente.

Kit para medir en forma secuencial (1) la fracción enzimáticamente activa y (2) la cantidad total de una enzima Campo de la invención La presente invención refiere a un kit combinado para medir en forma secuencial la fracción enzimáticamente activa y la cantidad total de una enzima [ (tal como mieloperoxidasa (MPO) ] en una muestra, y que ha dado como resultado aplicaciones mejoradas en el campo de la veterinaria y la salud humana.

Antecedentes de la invención La solicitud de patente internacional WO2005/075986 describe un procedimiento y kit para medir la activación de los neutrófilos.

Este procedimiento se basa en un de detección ELISA o SIEFED y un kit para medir el estado de activación de los neutrófilos en una muestra biológica obtenida de un mamífero, preferiblemente un caballo.

Este procedimiento se podría utilizar para la detección y/o predicción de enfermedades o patologías, para realizar un seguimiento de la activación de los neutrófilos durante la terapia en un mamífero enfermo, para evaluar la capacidad de los neutrófilos en la lucha contra los microorganismos y/o para destruirlos, para evaluar la eficiencia de los inmunomoduladores (o la capacidad inhibitoria in vitro de los medicamentos) mediante la comparación del estado de activación de los neutrófilos tratados y no tratados, para evaluar la capacidad de los neutrófilos tratados con dicho modulador y/o medicamento para luchar contra los microorganismos y/o para destruirlos, para evaluar la capacidad o habilidad de defensa natural de un mamífero para luchar contra los microorganismos y para detectar o seleccionar compuestos que interactúan con mieloperoxidasa (MPO) .

La Solicitud de Patente internacional W02005/075986 describe también el uso de procedimientos ELISA y SIEFED y kits para distinguir entre la mieloperoxidasa total y la activa (contenido de MPO) . No obstante, este documento no describe ni sugiere que la detección de MPO se pueda obtener a través de tales procedimientos en un bioensayo o procedimiento combinados con el mismo apoyo sólido con el mismo anticuerpo de unión o porción de anticuerpo.

Objeto de la invención La presente invención apunta a proporcionar un kit para realizar un bioensayo que no incluye los inconvenientes de la técnica y que permite medir la fracción activa y la cantidad total de una enzima en la misma muestra, en forma secuencial, con el mismo anticuerpo primario, con el mismo apoyo sólido.

Uno de los principales objetos de la presente invención es proporcionar un kit para bioensayos para utilizar en mediciones combinadas de la fracción enzimáticamente activa y la cantidad total de varios tipos de enzimas que participan en diferentes patologías, como cardiopatías y cáncer, preferiblemente enzimas como las que se encuentran en la arteriosclerosis.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar el kit de detección para bioensayos que reduce las demoras en la detección y el número de compuestos reactivos utilizados (en especial, el número de anticuerpos primarios utilizados, el número de apoyos sólidos utilizados y el número de enzimas purificadas para obtener la curva de calibración) .

Un último objeto de la presente invención es proponer un kit para bioensayos que permita la automatización de este bioensayo de detección y procedimiento en particular, permitiendo una medición simultánea de la activación de la fracción activa y cantidad total de diferentes tipos de enzimas, posiblemente presentes simultáneamente en la misma muestra biológica.

Definiciones El acrónimo ELISA significa "ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas" y el acrónimo SIEFED significa "extracción inmunitaria específica seguida de una detección enzimática".

La frase "medición secuencial de la fracción enzimáticamente activa y la cantidad total de una enzima presentes en una muestra biológica" significa un procedimiento de detección que, luego de unir la enzima en el anticuerpo primario inmovilizado permite medir la fracción enzimáticamente activa de una enzima (es decir, la detección se realiza en la enzima activa a través de la medición de la actividad enzimática con la adición de un sustrato y cosustrato adecuados) seguida de la medición de la cantidad total de la enzima que se aplica en la enzima activa o inactiva. El término "medición" significa detección y una posible cuantificación. La expresión 'inhibidor de la enzima' corresponde a un compuesto o agente que se combina con una enzima de modo de evitar la combinación normal entre sustrato y enzima y la reacción catalítica.

Sumario de la invención La invención refiere a un kit que comprende medios y herramientas para realizar una "extracción inmunitaria específica seguida de una detección enzimática" (SIEFED) y un "ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas" (ELISA) secuenciales para medir el estado de activación de una enzima (1) o células que puedan liberar la enzima en una muestra biológica obtenida de un mamífero, o medir los efectos de compuestos sintetizados o naturales en la enzima, que comprende:

- un anticuerpo primario (2) o porción hipervariable del mismo, ambos específicos para la enzima (1) y unidos a una superficie de apoyo sólido (3) ,

- un sustrato adecuado para que la enzima lo transforme en un producto de reacción visible y

- un anticuerpo secundario (4) o una porción hipervariable del mismo, ambos específicos para esta enzima, en los que el primer y el segundo anticuerpo no presentan reacción cruzada entre sí,

- reactivos adecuados para detectar un complejo anticuerpo primario (2) -enzima (1) - anticuerpo secundario (4) fijado en el apoyo sólido (3) ,

- una muestra de la enzima pura (1) con una actividad enzimática determinada y una cantidad total determinada, que se utilizará para establecer las curvas de referencia del procedimiento SIEFED, y luego ELISA;

caracterizado porque el kit comprende solo una superficie de apoyo sólido (3) .

En una realización adicional, el kit conforme a la invención es adecuado preferiblemente para mamíferos, preferiblemente un caballo o un humano.

En otra realización, el kit de la invención comprende un anticuerpo secundario o porción hipervariable del mismo, que está marcado, preferentemente mediante un acoplamiento a una enzima.

Otro aspecto de la presente memoria refiere a un procedimiento in vitro para realizar una medición (secuencial) de (primero) una fracción enzimáticamente activa y (segundo) una cantidad total de enzima (1) en una misma muestra biológica compleja. El procedimiento es un procedimiento SIEFED seguido de un procedimiento ELISA, y este procedimiento "SIEFED-ELISA combinado" se realiza con el mismo anticuerpo primario (2) o porción hipervariable del mismo, ambos específicos para la enzima, que están unidos a la misma superficie sólida (3) y en el que el procedimiento SIEFED y procedimiento ELISA se realizan en forma secuencial en la misma superficie de apoyo sólido (3) con el mismo anticuerpo primario.

El procedimiento se basa en una muestra biológica obtenida de un mamífero, que contiene la enzima (1) o células que pueden liberar esta enzima y comprende el paso posterior de:

1) inmunocapturar la enzima (1) presente en la muestra biológica a través de un anticuerpo primario (2) específico (policlonal o monoclonal) o una porción hipervariable del mismo, ambos específicos para la enzima (1) y unidos a la superficie de apoyo sólido (3) , 2) posiblemente extraer, mediante un primer paso de lavado, cualquier compuesto que interfiera con la medición de la actividad enzimática de la enzima inmunocapturada en la superficie de apoyo sólido (3) a través del anticuerpo primario (2) o una porción del mismo, 3) obtener, a través de una detección SIEFED y/o cuantificación mediante detección y/o medición de la actividad de la enzima (1) inmunocapturada, un valor medido de la actividad enzimática.

4) posiblemente comparar el valor medido de la actividad enzimática con valores normales de actividades enzimáticas obtenidos de un número significativo de mamíferos sanos y opcionalmente cuantificar un valor (nivel) de actividad enzimática mediante una curva enzimática estándar, 5) posiblemente extraer, mediante un segundo paso de lavado, cualquier sustrato y compuesto que se utilicen para,

o resulten de, los pasos de detección del procedimiento SIEFED y que estén presentes en la solución de la enzima

(1) inmunocapturada,

6) obtener, a partir de una detección ELISA, una cantidad medida total de enzima... [Seguir leyendo]

1. Un kit que comprende medios y herramientas para realizar una "extracción inmunitaria específica seguida de una detección enzimática" (SIEFED) y un "ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas" (ELISA) secuenciales para medir el estado de activación de una enzima (1) o células que puedan liberar la enzima en una muestra biológica obtenida de un mamífero, o medir los efectos de compuestos sintetizados o naturales en dicha enzima y que comprende:

- un anticuerpo primario (2) o porción hipervariable del mismo, ambos específicos para la enzima (1) y unidos a una superficie de apoyo sólido (3) ,

- un sustrato adecuado para que la enzima lo transforme en un producto de reacción visible y

- un anticuerpo secundario (4) o una porción hipervariable del mismo, ambos específicos para dicha enzima, 10 en el que el primer y el segundo anticuerpo no presentan reacción cruzada entre sí,

- reactivos adecuados para detectar un complejo anticuerpo primario (2) -enzima (1) -anticuerpo secundario (4) , fijado en el apoyo sólido (3) ,

- una muestra de la enzima (1) pura con una determinada actividad enzimática y una determinada cantidad total que se utilizará para establecer las curvas de referencia del procedimiento SIEFED y ELISA.

15. caracterizado porque solamente hay una superficie de apoyo sólido (3) presente.

2. El kit de la reivindicación 1, en el que el mamífero es un caballo.

3. El kit de la reivindicación 1, en el que el mamífero es un ser humano.

4. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo secundario o la porción hipervariable del mismo está marcado.

5. El kit de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo secundario o la porción hipervariable del mismo está marcado por un acoplamiento a una enzima.