Introducción selectiva de genes para la vacunación con células dendríticas.

Método in vitro para introducir un vector lentivírico que codifica un antígeno en una célula dendrítica queexpresa la DC-SIGN (no-integrina fijadora de ICAM-3 [moléculas de adhesión intracelular de tipo 3] específica de lascélulas dendríticas),

en donde el método comprende:

transducir la célula dendrítica con un virus recombinante, en donde el virus recombinante comprende dicho vectorlentivírico,

en donde el virus recombinante comprende una glucoproteína de alfavirus que reconoce selectivamente dicha célulaque expresa la DC-SIGN, en donde dicha glucoproteína es una glucoproteína E2 de alfavirus mutada en un sitio defijación al sulfato de heparano para disminuir o eliminar su fijación al sulfato de heparano.

Introduccion selectiva de genes para la vacunacion con celulas dendriticas

Antecedentes de invención La invencion se refiere de forma general a la introduccion selectiva de genes, y mas en particular, al uso de un virus 5 recombinante que comprende una molecula de reconocimiento selectivo que se dirige selectivamente a las celulas dendriticas y se fija a ellas, y puede, por lo tanto, utilizarse para vacunacion con celulas dendriticas.

La inmunizacion es una de las herramientas mas productivas en la practica medica moderna, pero permanece plagada de limitaciones. Algunas enfermedades infecciosas, tales como el VIH/sida, la malaria y la tuberculosis, siguen sin poderse controlar del todo mediante inmunizacion, mientras que otras enfermedades infecciosas estan 10 controladas por pautas complejas de inmunizacion. El cancer es una diana prometedora para los tratamientos inmunoterapicos, pero los resultados clinicos en los ensayos experimentales han sido desalentadores (Rosenberg, S.

A. et al, 2004, Nat. Med. 10: 909-915) . Se necesitan nuevos metodos de inmunizacion, por ejemplo, para inducir de forma fiable la inmunidad antitumoral.

Las celulas dendriticas (CD) desempefan funciones criticas en la inmunidad innata y en la adaptativa. Las CD son celulas presentadoras de antigeno especializadas con la (nica capacidad de capturar y procesar los antigenos, migrar desde la periferia hacia un organo linfatico y presentar los antigenos a los linfocitos T en reposo de una manera restringida por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) (Banchereau, J. & Steinman, R. M. 1998. Nature 392: 245-252; Steinman, R. M. et al., 2003. Ann. Rev. Immunol. 21: 685-711) . Estas celulas proceden de la medula osea (MO) y se caracterizan por la forma dendritica y su gran movilidad. Las CD inmaduras son duchas en la ingestion de antigenos y se distribuyen a modo de centinelas por los tejidos perifericos de todo el cuerpo. Sin embargo, es necesario que las CD maduren para montar una respuesta inmunitaria eficaz (Steinman, R. M. et al. 2003. vease mas arriba) . Las CD maduras expresan una gran cantidad del complejo CMH-antigeno y otras moleculas coestimuladoras (tales como CD40, B7-1, B7-2 y CD1a) (Steinman, R. M., 1991. Ann. Rev. Immunol. 9: 271-296, que se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad; Banchereau, J. y R. M. Steinman,

1998, vease mas arriba) . Estas moleculas desempefan funciones importantes a la hora de estimular los linfocitos T.

El descubrimiento de que las CD funcionan como celulas presentadoras de antigeno (CPA) especializadas ha impulsado la investigacion sobre la inmunizacion/vacunacion basada en las CD que implican cargar las CD con antigenos especificos (Banchereau, J. y Palucka, A. K. 2005. Nat. Rev. Immunol. 5: 296-306; Figdor, C. G. et al. 2004, Nat. Med. 10: 475-480) . Sin embargo, todos estos estudios implican hay que cargar ex vivo las CD con los antigenos especificos. A continuacion, las CD generadas ex vivo se administran al paciente. La generacion ex vivo de las CD para cada paciente es un procedimiento muy laborioso.

En comparacion, la presente invencion se refiere, entre otros, al reconocimiento selectivo, la carga de antigenos y la activacion de las CD in vivo, lo que da lugar al tratamiento in vivo de enfermedades mediante la generacion de una respuesta inmunitaria beneficiosa en el paciente. Asi pues, la invencion satisface una antigua necesidad de tratamientos eficaces y efectivos para la inmunizacion/vacunacion.

La patente internacional WO00/61772 se refiere a las composiciones y a los metodos para generar una respuesta inmunitaria mediante el empleo de sistemas de vectores basados en alfavirus. La patente internacional WO2005/118802 se refiere a la seudotipia de vectores retroviricos para la accion selectiva.

Compendio de la invención La invencion da a conocer un metodo in vitro de introduccion de un vector lentivirico, que codifica un antigeno, en una celula dendritica que expresa la DC-SIGN (no-integrina fijadora de ICAM-3 [moleculas de adhesion intracelular de tipo 3] especifica de las celulas dendriticas) , en donde el metodo comprende: la transduccion de la celula dendritica con un virus recombinante, en donde el virus recombinante comprende dicho vector lentivirico,

en donde el virus recombinante comprende una glucoproteina de alfavirus que reconoce selectivamente dicha celula 45 que expresa la DC-SIGN, en donde dicha glucoproteina es una glucoproteina E2 de alfavirus que esta mutada en un sitio de fijacion del sulfato de heparano para disminuir o eliminar su fijacion al sulfato de heparano.

La invencion da a conocer adicionalmente un virus recombinante que comprende un vector lentivirico que codifica un antigeno y una glucoproteina de alfavirus que reconoce selectivamente las celulas que expresan la DC-SIGN, en donde dicha glucoproteina es una glucoproteina E2 de alfavirus que esta mutada en un sitio de fijacion del sulfato de 50 heparano para disminuir o eliminar su fijacion al sulfato de heparano, para el uso en la estimulacion de una respuesta inmunitaria contra dicho antigeno en un mamifero.

La glucoproteina E2 de alfavirus que esta mutada en un sitio de fijacion del sulfato de heparano puede ser una glucoproteina E2 del Sindbis que esta mutada en un sitio de fijacion del sulfato de heparano. 2

En la explicacion de las realizaciones de la invencion de la presente memoria que viene a continuacion, la referencia a una «molecula de reconocimiento selectivo» o a una «molecula de reconocimiento selectivo que se fija a la DC-SIGN» se debe saber e interpretar que significa una glucoproteina E2 de alfavirus que esta mutada en un sitio de fijacion del sulfato de heparano para disminuir o eliminar su fijacion al sulfato de heparano.

La invencion se define adicionalmente en las reivindicaciones que la acompafan.

En algunas realizaciones, la molecula de reconocimiento selectivo es SINmu, tambien conocida como SVGmu (SEQ ID n.D 11) .

En algunas realizaciones, el antigeno puede ser un antigeno tumoral o un antigeno del VIH.

El virus recombinante se puede producir mediante la transfeccion de una linea celular de empaquetamiento con un vector virico que comprende el polinucleotido a introducir y un vector que comprende un gen que codifica la molecula de reconocimiento selectivo; el cultivo de la linea celular de empaquetamiento; y la recuperacion del virus recombinante a partir del cultivo de las celulas de empaquetamiento. En algunas realizaciones, la linea celular de empaquetamiento es una linea celular 293.

En algunas realizaciones de la invencion, el vector se introduce in vitro en una celula dendritica, mientras que en otras realizaciones el vector puede utilizarse para introducirlo in vivo en una celula dendritica de un sujeto. El sujeto es tipicamente un mamifero, tal como un humano, un raton o un conejillo de Indias.

La invencion puede utilizarse para metodos de estimulacion de una respuesta inmunitaria en un mamifero. Un polinucleotido que codifica un antigeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria se introduce en las celulas dendriticas que expresan la DC-SIGN al poner en contacto las celulas dendriticas con un vector

lentivirico que comprende el polinucleotido y una molecula de reconocimiento selectivo que se fija a la DC-SIGN.

El vector puede adicionalmente codificar uno o varios genes de interes, tal como un gen que codifica un antigeno y/o un gen que codifica un factor de maduracion de las celulas dendriticas.

La invencion se puede utilizar para metodos de tratamiento de un paciente con una enfermedad. Al paciente se le administra un virus recombinante, en donde el virus recombinante comprende un vector lentivirico que codifica un antigeno relacionado con la enfermedad y una molecula de reconocimiento selectivo que se fija a la DC-SIGN. La molecula de reconocimiento selectivo puede proceder de una glucoproteina virica. En algunas realizaciones, la molecula de reconocimiento selectivo es SVGmu (SEQ ID n.D 11) .

La enfermedad a tratar es por lo general una para la cual se conoce o se puede identificar un antigeno. En algunas realizaciones de la invencion, la enfermedad a tratar es cancer. En otras realizaciones, la enfermedad es VIH/sida.

Tambien se dan a conocer las celulas dendriticas transducidas con un virus recombinante tal y como se define mas arriba en la presente memoria. En algunas realizaciones, la molecula de reconocimiento selectivo es SVGmu (SEQ ID n.D 11) .

La invencion puede utilizarse para la inmunizacion de un mamifero mediante la introduccion de un polinucleotido, que codifica un antigeno, en las celulas dendriticas que expresan la DC-SIGN. En algunas realizaciones, las celulas dendriticas se ponen en contacto... [Seguir leyendo]

1. Metodo in vitro para introducir un vector lentivirico que codifica un antigeno en una celula dendritica que expresa la DC-SIGN (no-integrina fijadora de ICAM-3 [moleculas de adhesion intracelular de tipo 3] especifica de las celulas dendriticas) , en donde el metodo comprende:

transducir la celula dendritica con un virus recombinante, en donde el virus recombinante comprende dicho vector lentivirico,

en donde el virus recombinante comprende una glucoproteina de alfavirus que reconoce selectivamente dicha celula que expresa la DC-SIGN, en donde dicha glucoproteina es una glucoproteina E2 de alfavirus mutada en un sitio de fijacion al sulfato de heparano para disminuir o eliminar su fijacion al sulfato de heparano.

2. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha glucoproteina es una glucoproteina E2 del Sindbis mutada en un sitio de fijacion al sulfato de heparano.

3. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde el virus comprende una proteina E1 del Sindbis y dicha proteina E2 del Sindbis y opcionalmente (a) comprende secuencias de un genoma del virus de la leucemia murina (VLM) o de un genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , y/o (b) codifica un antigeno tumoral o un antigeno del VIH.

4. Virus recombinante seg (n se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una composicion farmaceutica que comprende dicho virus recombinante.

5. Virus recombinante que comprende un vector lentivirico que codifica un antigeno y una glucoproteina de alfavirus que reconoce selectivamente las celulas que expresan la DC-SIGN, en donde dicha glucoproteina es una glucoproteina E2 de alfavirus mutada en un sitio de fijacion al sulfato de heparano para disminuir o eliminar su fijacion al sulfato de heparano, para uso en la estimulacion de una respuesta inmunitaria contra dicho antigeno en un mamifero.

6. Virus recombinante para el uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde dicha glucoproteina es una glucoproteina E2 del Sindbis mutada en un sitio de fijacion al sulfato de heparano.

7. Virus recombinante para uso de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6, en donde el mamifero es humano.

8. Virus recombinante para uso de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6 o 7, en donde el virus comprende una proteina E1 del Sindbis y dicha proteina E2 del Sindbis.

9. Virus recombinante para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde el vector lentivirico comprende secuencias de un genoma de virus de la leucemia murina (VLM) o de un genoma de VIH.

10. Virus recombinante para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde el antigeno es un antigeno tumoral o un antigeno de VIH.

11. Virus recombinante para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en donde el virus recombinante codifica un segundo gen de interes, tal como un factor de maduracion seleccionado del grupo que consiste en GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando de CD40 (CD40L) y CD40 inducible por farmaco (iCD40) .

12. Celula dendritica transducida con un virus recombinante, en donde el virus recombinante se define seg (n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

13. Virus recombinante para uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde el antigeno es un antigeno asociado a tumor, antigeno virico, antigeno bacteriano, antigeno de hongo, antigeno de parasito protozoario, antigeno del parasito helmintico o antigeno de ectoparasito.

14. Virus recombinante para uso de acuerdo con la reivindicacion 13,

en donde dicho antigeno asociado a tumor se selecciona del grupo que consiste en receptor Her-2, MAGE, BAGE, RAGE, y NY-ESO, MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, tirosinasa y proteina relacionada con la tirosinasa, antigeno membranario especifico de la prostata (PSMA, por su nombre en ingles) , antigeno especifico de la prostata (PSA, por su nombre en ingles) , ras mutado, reorganizacion de bcr/abl, Her2/neu, p53 de tipo silvestre o mutado, citocromo P450 1B1, N-acetilglucosaminiltransferasa V; proteinas E6 y E7 del virus del papiloma humano; antigeno carcinoembrionario y a-fetoproteina;

en donde dicho antigeno virico se selecciona del grupo que consiste en polipeptidos de adenovirus, polipeptidos de alfavirus, polipeptidos de calicivirus, antigeno de la capsida de calicivirus, polipeptidos de coronavirus, polipeptidos del virus del moquillo, polipeptidos del virus del Ebola, polipeptidos de enterovirus, polipeptidos de flavivirus, polipeptidos del virus de la hepatitis (AE) , antigeno de la superficie o del n (cleo de la hepatitis B, polipeptidos de virus del herpes, glucoproteina del virus del herpes simple, glucoproteina del virus de la varicela zoster, polipeptidos de virus de la inmunodeficiencia, envoltura o proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana, polipeptidos del virus de la peritonitis infecciosa, polipeptidos del virus de la gripe, hemaglutinina de la gripe A, neuraminidasa de la gripe A, nucleoproteina de la gripe A, polipeptidos del virus de la leucemia, polipeptidos del virus de Marburg, polipeptidos de ortomixovirus, polipeptidos del virus del papiloma, polipeptidos del virus de la paragripe, hemaglutinina/neuraminidasa del virus de la paragripe, polipeptidos de paramixovirus, polipeptidos de parvovirus, polipeptidos de pestivirus, polipeptidos de picornavirus, polipeptido de la capsida del virus de la polio, polipeptidos del virus de la viruela, polipeptido del virus de la variolovacuna, polipeptidos del virus de la rabia, glucoproteina G del virus de la rabia, polipeptidos de reovirus, polipeptidos de retrovirus y polipeptidos de rotavirus;

en donde dicho antigeno bacteriano se selecciona del grupo que consiste en polipeptidos de Actinomyces, polipeptidos de Bacillus, polipeptidos de Bacteroides, polipeptidos de Bordetella, polipeptidos de Bartonella, polipeptidos de Borrelia, OspA de B. burgdorferi, polipeptidos de Brucella, polipeptidos de Campylobacter, polipeptidos de Capnocytophaga, polipeptidos de Chlamydia, polipeptidos de Clostridium, polipeptidos de Cor y nebacterium, polipeptidos de Coxiella, polipeptidos de Dermatophilus, polipeptidos de Enterococcus, polipeptidos de Ehrlichia, polipeptidos de Escherichia, polipeptidos de Francisella, polipeptidos de Fusobacterium, polipeptidos de Haemobartonella, polipeptidos de Haemophilus, proteina de la membrana externa de tipo b de H. influenzae, polipeptidos de Helicobacter, polipeptidos de Klebsiella, polipeptidos de bacterias con forma de L, polipeptidos de Leptospira, polipeptidos de Listeria, polipeptidos de Mycobacteria, polipeptidos de Mycoplasma, polipeptidos de Neisseria, polipeptidos de Neorickettsia, polipeptidos de Nocardia, polipeptidos de Pasteurella, polipeptidos de Peptococcus, polipeptidos de Peptostreptococcus, polipeptidos de Pneumococcus, polipeptidos de Proteus, polipeptidos de Pseudomonas, polipeptidos de Rickettsia, polipeptidos de Rochalimaea, polipeptidos de Salmonella, polipeptidos de Shigella, polipeptidos de Staphylococcus, polipeptidos de Streptococcus, proteinas M de S. pyogenes, polipeptidos de Treponema y polipeptidos de Yersinia, antigeno F1 de Y. pestis y antigeno V de Y. pestis;

en donde dicho antigeno de hongo se selecciona del grupo que consiste en polipeptidos de Absidia, polipeptidos de Acremonium, polipeptidos de Alternaria, polipeptidos de Aspergillus, polipeptido de Basidiobolus, polipeptidos de Bipolaris, polipeptidos de Blastomyces, polipeptidos de Candida, polipeptidos de Coccidioides, polipeptidos de Conidiobolus, polipeptidos de Cr y ptococcus, polipeptidos de Curvalaria, polipeptidos de Epidermophyton, polipeptidos de Exophiala, polipeptidos de Geotrichum, polipeptidos de Histoplasma, polipeptidos de Madurella, polipeptidos de Malassezia, polipeptidos de Microsporum, polipeptidos de Moniliella, polipeptido de Mortierella, polipeptidos de Mucor, polipeptidos de Paecilomyces, polipeptidos de Penicillium, polipeptidos de Phialemonium, polipeptidos de Phialophora, polipeptidos de Prototheca, polipeptidos de Pseudallescheria, polipeptidos de Pseudomicrodochium, polipeptidos de Pythium, polipeptidos de Rhinosporidium, polipeptidos de Rhizopus, polipeptidos de Scolecobasidium, polipeptidos de Sporothrix, polipeptidos de Stemphylium, polipeptidos de Trichophyton, polipeptidos de Trichosporon y polipeptidos de Xylohypha;

en donde dicho antigeno de protozoo se selecciona del grupo que consiste en polipeptidos de Babesia, polipeptidos de Balantidium, polipeptidos de Besnoitia, polipeptidos de Cr y ptosporidium, polipeptidos de Eimeria, polipeptidos de Encephalitozoon, polipeptidos de Entamoeba, polipeptidos de Giardia, polipeptidos de Hammondia, polipeptidos de Hepatozoon, polipeptidos de Isospora, polipeptidos de Leishmania, polipeptidos de Microsporidia, polipeptidos de Neospora, polipeptidos de Nosema, polipeptidos de Pentatrichomonas, polipeptidos de Plasmodium, circunesporozoito de P. falciparum (PfCSP) , proteina 2 de la superficie de esporozoito (PfSSP2) , extremo carboxilo del antigeno 1 del estado del higado (PfLSA1 c-term) , proteina 1 exportada (PfExp-1) , polipeptidos de Pneumocystis, polipeptidos de Sarcocystis, polipeptidos de Schistosoma, polipeptidos de Theileria, polipeptidos de Toxoplasma y polipeptidos de Tr y panosoma;

en donde dicho antigeno de helminto se selecciona del grupo que consiste en polipeptidos de Acanthocheilonema, polipeptidos de Aelurostrongylus, polipeptidos de Ancylostoma, polipeptidos de Angiostrongylus, polipeptidos de Ascaris, polipeptidos de Brugia, polipeptidos de Bunostomum, polipeptidos de Capillaria, polipeptidos de Chabertia, polipeptidos de Cooperia, polipeptidos de Crenosoma, polipeptidos de Dictyocaulus, polipeptidos de Dioctophyme, polipeptidos de Dipetalonema, polipeptidos de Diphyllobothrium, polipeptidos de Diplydium, polipeptidos de Dirofilaria, polipeptidos de Dracunculus, polipeptidos de Enterobius, polipeptido de Filaroides, polipeptidos de Haemonchus, polipeptidos de Lagochilascaris, polipeptidos de Loa, polipeptidos de Mansonella, polipeptidos de Muellerius, polipeptidos de Nanophyetus, polipeptidos de Necator, polipeptidos de Nematodirus, polipeptidos de Oesophagostomum, polipeptidos de Onchocerca, polipeptidos de Opisthorchis, polipeptidos de Ostertagia, polipeptidos de Parafilaria, polipeptidos de Paragonimus, polipeptidos de Parascaris, polipeptidos de Physaloptera, polipeptidos de Protostrongylus, polipeptidos de Setaria, polipeptidos de Spirocerca, polipeptidos de Spirometra, polipeptidos de Stephanofilaria, polipeptidos de Strongyloides, polipeptidos de Strongylus, polipeptidos de Thelazia, polipeptidos de Toxascaris, polipeptidos de Toxocara, polipeptidos de Trichinella, polipeptidos de Trichostrongylus, polipeptidos de Trichuris, polipeptidos de Uncinaria y polipeptidos de Wuchereria; y en donde dicho antigeno de ectoparasito se selecciona del grupo que consiste en polipeptidos de pulga; polipeptidos de garrapatas, polipeptidos de garrapatas duras, polipeptidos de garrapatas blandas; polipeptidos de moscas, polipeptidos de mosquito pequefo, polipeptidos de mosquito zancudo, polipeptidos de mosquito transmisor de la leishmaniosis, polipeptidos de moscas negras, polipeptidos del tabano, polipeptido de la mosca del cuerno,

polipeptido de tabanidos, polipeptidos de la mosca tse-tse, polipeptidos de la mosca mordedora, polipeptidos de la mosca que ocasiona la miasis y polipeptidos de la mosca zancuda chupadora; polipeptidos de la mosca de la hormiga; polipeptidos de la mosca de la arafa, polipeptidos de la mosca de los piojos; polipeptidos de la mosca de los acaros, polipeptidos de la mosca de las chinches de la cama y polipeptido de la mosca de los insectos chupasangre.

15. Virus recombinante para uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde el virus recombinante se administra por via subcutanea o intradermica.