Interferencia de RNA mediadora de moléculas pequeñas de RNA.

Una molécula de siRNA sintético aislada que tiene una cadena antisentido y una cadera sentido

, en donde cada cadena tiene una longitud de 21 nucleótidos y en donde el siRNA tiene una región central de complementariedad de 19 pares de bases, y en donde el siRNA tiene dos colgantes de nucleótidos 3' en cada cadena, en donde el combate 3' de la cadena sentido está constituido por dos nucleótidos cualesquiera y el colgante 3' de la cadena antisentido está constituido por 5'-UG-3' o 5'-TdG-3', en donde dicha molécula de siRNA es capaz de mediar la interferencia de RNA específica de la diana.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10179952.

Solicitante: MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FORDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V..

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: HOFGARTENSTRASSE 8 80539 MUNCHEN ALEMANIA.

Inventor/es: TUSCHL,THOMAS, ELBASHIR,SAYDA, LENDECKEL,WINFRIED, WILM,MATTHIAS, LÜHRMANN,Reinhard.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > C07H21/00 (Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > A61P35/00 (Agentes antineoplásicos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K48/00 (Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N1/00 (Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION;... > A01H5/00 (Plantas con flores, es decir, angiospermas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K45/00 (Preparaciones medicinales que contienen ingredientes activos no previstos en los grupos A61K 31/00 - A61K 41/00)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/68 (en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > A61P43/00 (Medicamentos para usos específicos, no previstos en los grupos A61P 1/00 - A61P 41/00)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K9/00 (Preparaciones medicinales caracterizadas por un aspecto particular)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/02 (en los que intervienen microorganismos vivos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/10 (Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos,... > A61P31/12 (Antivirales)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > CRIA; AVICULTURA, PISCICULTURA, APICULTURA; PESCA;... > Cría u obtención de animales, no prevista en otro... > A01K67/027 (Nuevas razas de vertebrados)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > Medicamentos para el tratamiento de problemas inmunológicos... > A61P37/02 (Inmunomoduladores)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K38/00 (Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/02 (que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/15 (preparaciones medicinales)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen ingredientes... > A61K31/7105 (Acidos ribonucleicos naturales, es decir conteniendo unicamente ribosas unidas a la adenina, la guanina, la citosina, o el uracilo y teniendo enlaces 3'-5' fosfodiester)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/113 (Acidos nucleicos no codificantes que modulan la expresión de genes, p.ej. oligonucleótidos antisentido)

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Ilustración 1 de Interferencia de RNA mediadora de moléculas pequeñas de RNA.
Ilustración 2 de Interferencia de RNA mediadora de moléculas pequeñas de RNA.
Ilustración 3 de Interferencia de RNA mediadora de moléculas pequeñas de RNA.
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Interferencia de RNA mediadora de moléculas pequeñas de RNA.

Fragmento de la descripción:

Interferencia de RNA mediadora de moléculas pequeñas de RNA.

La presente invención se refiere a características de secuencia y estructurales de moléculas de (ds) RNA bicatenario requeridas para mediar modificaciones de ácido nucleico específicas de la diana tales como la interferencia de RNA y/o metilación del DNA.

La expresión “Interferencia de RNA” (RNAi) fue acuñada después del descubrimiento de que la inyección de dsRNA en el nematodo C. elegans conduce a silenciación específica de genes sumamente homólogos en secuencia al dsRNA administrado (Fire et al., 1998) . La RNAi fue observada también posteriormente en insectos, ranas (Oelgeschlager et al., 2000) , y otros animales con inclusión de ratones (Svoboda et al., 2000; Wianny y Zernicka-Goetz, 2000) y es probable que exista también en humanos. La RNAi está ligada estrechamente al mecanismo de cosupresión postranscripcional de silenciación de genes (PTGS) en las plantas y destrucción en los hongos (Catalanotto et al., 2000; Cogoni y Macino, 1999; Dalmay et al., 2000; Ketting y Plasterk, 2000; Mourrain et al., 2000; Smardon et al., 2000) y algunos componentes de la maquinaria de la RNAi son necesarios también para silenciación postranscripcional por co-supresión (Catalanotto et al., 2000; Dernburg et al., 2000; Ketting y Plasterk, 2000) . El tópico ha sido revisado también recientemente (Bass, 2000; Bosher y Labouesse, 2000; Fire, 1999; Plasterk y Ketting, 2000; Sharp, 1999; Sijen y Kooter, 2000) , véase también el número completo de Plant Molecular Biology, vol. 43, número 2/3, (2000) .

En las plantas, además de PTGS, los transgenes introducidos pueden conducir también a silenciación transcripcional de genes por metilación del DNA de citosinas dirigida por RNA (véanse referencias en Wassenegger, 2000) . Dianas genómicas tan cortas como 30 pb están metiladas en plantas de manera dirigida por RNA (Pelissier, 2000) . La metilación del DNA está presente también en los mamíferos.

La función natural de RNAi y la co-supresión parece ser protección del genoma contra la invasión por elementos genéticos móviles tales como retrotransposones y virus que producen RNA o dsRNA aberrante en la célula hospedadora cuando se vuelven activos (Jensen et al., 1999; Ketting et al., 1999; Ratcliff et al., 1999; Tabara et al., 1999) . La degradación específica del mRNA evita la replicación de transposones y virus, aunque algunos virus son capaces de contrarrestar o prevenir este proceso por expresión de proteínas que suprimen la PTGS (Lucy et al., 2000; Voinnet et al., 2000) .

El dsRNA desencadena la degradación específica de RNAs homólogos únicamente dentro de la región de identidad con el dsRNA (Zamore et al., 2000) . El dsRNA se procesa a fragmentos de RNA de 21-23 nt y los sitios de escisión del RNA diana están distanciados regularmente con una separación de 21-23 nt. Por esta razón, se ha sugerido que los fragmentos de 21-23 nt son los RNAs guía para reconocimiento de la diana (Zamore et al., 2000) . Estos RNAs cortos fueron detectados también en extractos preparados a partir de células Schneider 2 de D. melanogaster que se transfectaron con dsRNA antes de la lisis celular (Hammond et al., 2000) ; sin embargo, las fracciones que exhibían actividad de nucleasa específica de la secuencia contenían también una gran fracción de dsRNA residual. El papel de los fragmentos de 21-23 nt en el guiamiento de la escisión de mRNA se ve respaldado adicionalmente por la observación de que fragmentos de 21-23 nt aislados de dsRNA procesado son capaces, en cierto grado, de mediar la degradación específica de mRNA (Zamore et al., 2000) . Moléculas de RNA de tamaño similar se acumulan también en tejido vegetal que exhibe PTGS (Hamilton y Baulcombe, 1999) .

En este caso, los autores de la presente invención utilizan el sistema establecido de Drosophila in vitro (Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000) para explorar adicionalmente el mecanismo de la RNAi. Se demuestra aquí que RNAs cortos de 21 y 22 nt, cuando están apareados en bases con extremos 3’ colgantes, actúan como los RNAs guía para degradación del mRNA específica de la secuencia. Los dsRNAs cortos de 30 pb son incapaces de mediar la RNAi en este sistema debido a que ya no se procesan a RNAs de 21 y 22 nt. Adicionalmente, se definen los sitios de escisión de RNA diana con relación a los RNAs de interferencia cortos de 21 y 22 nt (siRNAs) y se aporta evidencia de que la dirección de procesamiento del dsRNA determina si un RNA diana sentido o antisentido puede ser escindido por el complejo siRNA-endonucleasa producido. Adicionalmente, los siRNAs pueden ser también instrumentos importantes para modulación de la transcripción, v.g. silenciación de genes de mamífero por guiamiento de la metilación del DNA.

Experimentos adicionales en sistemas de cultivo de células humanas in vivo (células HeLa) demuestran que moléculas de RNA bicatenario que tienen preferiblemente una longitud de 19-25 nucleótidos tienen actividad de RNAi. Así, en contraste con los resultados de Drosophila, también moléculas de RNA bicatenario de 24 y 25 nt de longitud son eficientes para la RNAi.

El objeto subyacente de la presente invención es proporcionar nuevos agentes capaces de mediar la Interferencia de RNA específica de la diana u otras modificaciones de ácido nucleico específicas de la diana tales como metilación del DNA, teniendo dichos agentes eficacia y seguridad mejoradas comparados con agentes de la técnica anterior.

La solución de este problema se proporciona por una molécula de RNA sintética aislada que tiene una cadena antisentido y una cadena sentido, en donde cada cadena de RNA tiene una longitud de 21 nucleótidos en donde dicha molécula de RNA es capaz de mediar modificaciones del ácido nucleico específicas de la diana, particularmente interferencia de RNA y/o metilación del DNA. El siRNA tiene una región central de complementariedad de 19 pares de bases, y tiene un colgante 3’ de 2 nucleótidos en cada cadena, en donde el colgante 3’ de la cadena sentido está constituido por 2 nucleótidos cualesquiera y el colgante 3’ de la cadena antisentido está constituido por 5’-UG-3’ o 5’-TdG-3’. La molécula de RNA es preferiblemente una molécula de RNA sintética que está sustancialmente exenta de contaminantes existentes en los extractos de células, v.g. embriones de Drosophila. Adicionalmente, la molécula de RNA está con preferencia sustancialmente exenta de cualesquiera contaminantes no específicos de la diana, particularmente moléculas de RNA no específicas de la diana, v.g. de contaminantes existentes en extractos de células.

Sorprendentemente, se encontró que moléculas de RNA bicatenario sintético corto, particularmente con extremos 3’ colgantes son mediadores específicos de secuencia de RNAi y median la escisión eficiente del RNA diana, en donde el sitio de escisión está localizado cerca del centro de la región abarcada por el RNA guía corto.

Las cadenas de RNA tienen preferiblemente grupos hidroxilo 3’. El término 5’ comprende preferiblemente un grupo fosfato, difosfato, trifosfato o hidroxilo. Los dsRNAs más eficaces están compuestos de dos cadenas de 21 nt que se aparean de tal modo que están presentes colgantes 3’ de 2 nt en ambos extremos del dsRNA.

La reacción de escisión del RNA diana guiada por siRNAs es altamente específica de la secuencia. Sin embargo, no todas las posiciones de un siRNA contribuyen por igual al reconocimiento de la diana. Los desapareamientos en el centro del dúplex de siRNA son sumamente críticos y anulan esencialmente la escisión del RNA diana. En contraste, el nucleótido 3’ de la cadena de siRNA (v.g. la posición 21)... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una molécula de siRNA sintético aislada que tiene una cadena antisentido y una cadera sentido, en donde cada cadena tiene una longitud de 21 nucleótidos y en donde el siRNA tiene una región central de complementariedad de 19 pares de bases, y en donde el siRNA tiene dos colgantes de nucleótidos 3' en cada cadena, en donde el combate 3’ de la cadena sentido está constituido por dos nucleótidos cualesquiera y el colgante 3' de la cadena antisentido está constituido po.

5. UG-3' .

5. TdG-3', en donde dicha molécula de siRNA es capaz de mediar la interferencia de RNA específica de la diana.

2. La molécula de siRNA conforme a la reivindicación 1, en donde las cadenas de RNA están sintetizados químicamente o sintetizadas enzimáticamente.

3. La molécula de siRNA bicatenario aislada conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha molécula de siRNA contiene al menos un análogo de nucleótido modificado.

4. La molécula de siRNA conforme a la reivindicación 3, en donde el siRNA bicatenario comprende al menos un ribonucleótido modificado en el azúcar, en donde el grupo 2’-OH de dicho ribonucleótido modificado en el azúcar está reemplazado por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, N (R) 2 o CN, en donde R es C1-C6 alquilo, alquenilo o alquinilo y halo es F, Cl, Br o I.

5. La molécula de siRNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el RNA bicatenario comprende al menos un ribonucleótido modificado en la cadena principal que contiene un grupo fosforotioato.

6. La molécula de siRNA bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que tiene una identidad de al menos 70 por ciento con una secuencia diana predeterminada.

7. Un método in vitro de mediación de la interferencia de RNA específica de la diana en una célula o un organismo que comprende los pasos: (a) puesta en contacto de dicha célula u organismo con la molécula de siRNA bicatenario conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en condiciones en las que puede ocurrir interferencia de RNA específica de la diana, y (b) mediación de la interferencia de RNA específica de la diana efectuada por el siRNA bicatenario hacia un ácido nucleico diana que tiene una porción de secuencia que corresponde sustancialmente al siRNA bicatenario.

8. El método in vitro conforme a la reivindicación 7, en donde dicha puesta en contacto comprende introducir dicha molécula de siRNA bicatenario en una célula diana en la que puede ocurrir interferencia de RNA específica de la diana.

9. Una composición que comprende al menos una molécula de siRNA conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un portador.

10. La composición conforme a la reivindicación 9, en donde dicho portador es adecuado para aplicaciones de diagnóstico y/o aplicaciones terapéuticas.

FIGURA 1A

FIGURA 2

pb tiempo (h)

diana sentido diana antisentido

FIGURA 3A

FIGURA 3B

diana sentido diana antisentido

FIGURA 4A

pb

pb

111 pb

FIGURA 4B

FIGURA 6A

sentido

antisentido

reconocimiento de dsRNA por

los extremos del dsRNA

procesamiento del dsRNA

escisión del RNA escisión del RNA

diana sentido diana antisentido

RNA diana RNA diana

sentido antisentido

FIGURA 7

Fig. 11 Parte II

Fig. 11 Parte III

FIGURA 13

inserción de pares de bases (B)

inserción de pares de bases (C)

Pp–luc/Rr–luc norm.

longitud de los siRNAs longitud de los siRNAs

FIGURA 16

FIGURA 18

Pp–luc/Rr–luc norm.

FIGURA 19

Pp–luc/Rr–luc norm.

longitud (nt) saliente 3'

Mosca Mosca In vitro In vitro Pp–luc/Rr–luc norm.

longitud (nt) saliente 3'