Instrumento para la realización de imágenes de campo ancho a distintas profundidades de un espécimen.

Instrumento para la realización de imágenes de un espécimen, de campo ancho y que comprende (1) un dispersor de divergencias, que genera en un haz de luz distintas divergencias en cada una de sus componentes cromáticas para formar imágenes del espécimen a distintas profundidades del mismo y (2) un analizador de longitudes de onda, que selecciona la longitud de onda o intervalo de longitudes de onda del haz de luz para formar la imagen del espécimen a una profundidad específica. El haz de luz puede ser mono o policromático y el instrumento puede tener una configuración de iluminación por transmisión o por reflexión. El instrumento puede además ser modificado mediante distintas configuraciones del dispersor de divergencias y/o del analizador de longitudes de onda, incluyendo su motorización o la inclusión de una máscara móvil, así como acoplarse a una cámara CCD o CMOS para integrar las distintas imágenes adquiridas de todas las secciones del espécimen.

Instrumento para la realización de imágenes de campo ancho a distintas profundidades de un espécimen.

La presente invención se refiere, en general, al campo de la óptica y en particular al campo de la microscopía.

Estado de la técnica

Una necesidad habitual en el campo de la microscopía óptica es la de seleccionar la profundidad de la sección del espécimen del que se desea formar imagen, independientemente de que la imagen se registre mediante la utilización de cámaras o por inspección ocular directa. A menudo esta necesidad se extiende a la realización de imágenes correspondientes a varias profundidades. Una solución es la de modificar mediante elementos mecánicos (ya sean de tipo manual o motorizado) la posición del espécimen (microscopios tradicionales) o la del objetivo de microscopio (microscopios invertidos, véase por ejemplo la patente US 6, 160, 662) , con el fin de seleccionar el plano del espécimen que se desea observar. De esta manera pueden obtenerse imágenes de planos a diferentes profundidades, con las que se puede reconstruir una única imagen con profundidad de foco extendida. Sin embargo, mediante esta técnica, la imagen final resulta desenfocada, al no filtrarse las contribuciones de otros planos que están fuera de foco.

Una solución para suprimir contribuciones de planos fuera de foco se encuentra en el campo de la denominada “microscopía confocal” (patente US 3, 013, 467) . En esta aproximación, la inserción de una apertura en alguno de los planos conjugados del brazo de imagen del microscopio garantiza la formación de la imagen de un único punto del espécimen situado en un plano definido sin que la señal detectada se vea afectada por luz proveniente de otros puntos del mismo plano focal o de otros planos. La formación de imágenes con luz proveniente únicamente de un determinado plano se denomina seccionado óptico, y conlleva la ventaja de un mayor contraste en la imagen.

Los microscopios confocales presentan el inconveniente de que en el plano imagen del instrumento se obtiene únicamente la imagen de un punto o un conjunto limitado de puntos, pero en ningún caso una imagen bidimensional completa del plano bajo estudio. Como consecuencia, en un microscopio confocal, para registrar una imagen del plano bajo observación, se debe llevar a cabo un barrido punto a punto del espécimen en la dirección trasversal al eje óptico del sistema (microscopía confocal de barrido) . Ello se traduce en que el tiempo necesario para reconstruir la imagen del plano bajo observación es, en general, mayor que el necesario en un microscopio convencional. Además, al igual que en los microscopios convencionales, para poder acceder a planos ubicados a diferentes profundidades, se requiere hacer uso de un elemento mecánico que permita la modificación de la distancia relativa entre el objetivo de microscopio y el espécimen.

La “microscopía confocal cromática” (patente US 6, 038, 066) es una variante de la microscopía confocal que permite, en cada punto, acceder a los planos situados a diferentes profundidades. En esta variante se consigue codificar la profundidad en términos de longitud de onda de la luz, mediante la introducción deliberada de aberración cromática en el sistema óptico. Sin embargo, esta técnica requiere, al igual que la microscopía confocal de barrido, un barrido transversal al eje óptico para reconstruir cualquier imagen del espécimen.

Una forma alternativa de hacer seccionado óptico es la técnica de seccionado óptico por iluminación estructurada (patente US 6, 819, 415) . En esta técnica, se inserta en el brazo de iluminación del microscopio óptico, una máscara de transmisión (típicamente un patrón de franjas periódicas) en alguno de los planos conjugados con el plano de imagen, de tal forma que se proyecta sobre el espécimen el mismo patrón espacial, con el correspondiente factor de “demagnificación”. Típicamente se toman un conjunto de imágenes del espécimen en una cámara, en las que se varía de forma controlada la posición lateral de la máscara y, por tanto, del patrón de iluminación. La imagen final se reconstruye digitalmente tras la recombinación de las imágenes capturadas, con el objetivo de eliminar las frecuencias espaciales bajas que provienen en su mayor parte de planos desenfocados. De esta forma se recupera sólo la información en foco, es decir, se realiza un seccionado óptico.

Esta técnica de seccionado óptico ha alcanzado un gran nivel de desarrollo (Siegel y col., Opt. Lett. 26, 1338-1340, (2001) ) y en su forma básica es relativamente común a nivel comercial. Sin embargo, como otras aproximaciones ya descritas, está limitada a una única profundidad de observación, por lo que exige el movimiento relativo entre el objetivo del microscopio y el espécimen para obtener secciones ópticas correspondientes a diferentes planos en profundidad.

La presente invención comprende un instrumento que supera las dos limitaciones fundamentales anteriormente descritas: 1) la necesidad de seleccionar el plano bajo observación mediante el desplazamiento relativo entre el objetivo del microscopio y el espécimen a lo largo del eje óptico del sistema y 2) la de reconstruir por barrido del espécimen en el plano trasversal al eje óptico del sistema la imagen del plano que se ha seccionado, para lograr una imagen bidimensional. Este instrumento permite seleccionar de forma precisa la profundidad en el espécimen de la que se quiere formar imagen sin utilizar elementos mecánicos que modifiquen la posición relativa del espécimen, y que encarecen el precio del producto. Además, por no ser confocal, se forma directamente una imagen bidimensional, por lo que no requiere de un escaneo transversal al eje óptico que ralentizaría el proceso de adquisición. Así pues la presente invención supera las dos limitaciones fundamentales anteriormente descritas, resultando en un instrumento de microscopía más rápido, robusto y sencillo, y menor coste de fabricación.

Descripción de la invención

En la presente invención se desarrolla un instrumento para la realización de imágenes a distintas profundidades de un espécimen, que comprende al menos un sistema dispersor de divergencias (SDD) y un analizador de longitudes de onda (ALO) , caracterizado porque las imágenes que proporcionan las distintas longitudes de onda se corresponden con distintas profundidades en el espécimen. Este instrumento, expresamente, no requiere el desplazamiento relativo entre el objetivo del instrumento y el espécimen en ninguna de las tres direcciones espaciales, ni para tomar cada una de las imágenes, ni para seleccionar la profundidad en el mismo.

En la Figura 1 se muestra un esquema general del instrumento objeto de la invención. Está formado únicamente por elementos ópticos estándar y un sistema que permite seleccionar la longitud de onda que forma la imagen. Esta invención admite la motorización de algunos de sus elementos, sin ser imprescindible para su correcto funcionamiento. En el campo de la óptica en general, la disposición de la iluminación de la Figura 1, en la que la dirección de iluminación es la misma que la del brazo de recolección de la luz pero su sentido es contrario, se conoce como iluminación por reflexión. En la Figura 1 y sucesivas, los distintos tipos de trazos (ya sean líneas continuas, líneas discontinuas o líneas punteadas) muestran de forma esquemática los caminos ópticos de distintas longitudes de onda.

En la Figura 1, un haz de luz policromática es introducido en el SDD mediante un divisor de haz. El SDD tiene como función producir un haz cuya divergencia es función de la longitud de onda. De esta forma, si el SDD está constituido de materiales que presentan dispersión normal (en contraposición a aquellos que presentan dispersión anómala) , las componentes de la luz de longitud de onda más largas llegarán a la pupila de entrada del objetivo del instrumento con una divergencia mayor que aquellas de longitud menor. Así pues, el conjunto policromático de haces atravesará el objetivo del microscopio con diferentes divergencias, y las diferentes longitudes de onda serán enfocadas en planos situados a diferentes profundidades del espécimen.

El rango de profundidades accesibles (RPA, diferencia de profundidad entre el plano en el que se enfoca la longitud de onda más corta y el plano en el que se enfoca la longitud de onda más larga) está directamente relacionado con la dispersión cromática del material del que esté formado...

1. Instrumento para la realización de imágenes de un espécimen, caracterizado porque es de campo ancho o amplio y porque comprende al menos:

a. un dispersor de divergencias, que genera en un haz de luz distintas divergencias en cada una de sus componentes cromáticas para formar imágenes del espécimen a distintas profundidades del mismo, y

b. un analizador de longitudes de onda, que selecciona la longitud de onda o intervalo de longitudes de onda del haz de luz para formar la imagen del espécimen a una profundidad específica.

2. Instrumento según la reivindicación 1, caracterizado porque el haz de luz es policromático.

3. Instrumento según la reivindicación 1, caracterizado porque el haz de luz es monocromático.

4. Instrumento según la reivindicación 3, caracterizado porque el haz de luz es generado por una fuente o fuentes que permiten seleccionar la longitud de onda del mismo.

5. Instrumento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el dispersor de divergencias colecta el haz de luz reflejado por el espécimen.

6. Instrumento según cualquiera de las reivindicaciones1a4, caracterizado porque el dispersor de divergencias colecta el haz de luz que ha atravesado el espécimen.

7. Instrumento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque proyecta sobre el espécimen un patrón de intensidad mediante una máscara insertada en el haz de luz y que se desplaza lateralmente respecto al eje del mismo.

8. Instrumento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque puede variarse el rango de profundidades accesibles mediante un sistema dispersor de divergencias que comprende al menos dos singletes cuya distancia de separación puede modificarse de manera controlada.

9. Instrumento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sistema dispersor de divergencias comprende un intercambiador de elementos ópticos.

10. Instrumento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el analizador de longitudes de onda comprende un filtro espectral o un intercambiador de filtros espectrales.

11. Instrumento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el analizador de longitudes de onda comprende la combinación de al menos un polarizador y una lámina birrefringente cuyos ejes principales forman un ángulo que puede variarse de manera controlada, seleccionando así la longitud de onda.

12. Instrumento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque cualquiera de los elementos constituyentes del sistema dispersor de divergencias o del analizador de longitudes de onda está motorizado.

13. Uso del instrumento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la obtención de imágenes de diversas profundidades del espécimen.

14. Uso de un instrumento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la obtención de una imagen que integra imágenes de varias profundidades del espécimen.

15. Uso de un instrumento según cualquiera de las reivindicaciones1a12en combinación con un sistema digital de reconstrucción o procesado de las imágenes.

16. Uso de un instrumento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 para el seccionado óptico a varias profundidades.