INSERCIÓN MEJORADA DIRECCIONADA DE DNA EN LAS PLANTAS.

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular de las plantas, más específicamente al campo de la ingeniería genómica de las plantas. Se proporcionan métodos para la introducción dirigida de un fragmento de DNA extraño en un sitio de inserción preseleccionado en el genoma de una planta. Las plantas que contienen el DNA extraño insertado en un sitio particular se pueden obtener ahora con una mayor frecuencia y con mayor exactitud que lo que es posible con los métodos de inserción direccionada de DNA disponibles actualmente. Además, en una gran proporción de las plantas resultantes, el DNA extraño se ha insertado solamente en el sitio de inserción preseleccionado, sin que el DNA extraño se haya insertado aleatoriamente en otras localizaciones en el genoma de la planta. Los métodos de la invención son así una mejora, tanto cuantitativa como cualitativamente, con respecto a los métodos de la técnica anterior. Se proporcionan también genes quiméricos, plásmidos, vectores y otros medios para ser usados en los métodos de la invención. Antecedentes de la invención La primera generación de plantas transgénicas a principios de los años 80 del siglo pasado por tecnología de transformación mediada por Agrobacterium ha estimulado el desarrollo de otros métodos para introducir un DNA extraño de interés o un transgén en el genoma de una planta, tales como la incorporación de DNA mediada por PEG en protoplastos, bombardeo con microproyectiles, transformación mediada por triquitas de silicio, etc. Sin embargo, todos los métodos de transformación de plantas tienen en común que los transgenes incorporados en el genoma de la planta se integran de una manera aleatoria y en número de copias impredecible. Con frecuencia, los transgenes pueden integrarse en forma de repeticiones, ya sea del transgén completo o de partes del mismo. Un patrón de integración compleja de este tipo puede influir en el nivel de expresión de los transgenes, v.g. por destrucción del DNA transcrito por mecanismos de silenciación de genes posteriores a la transcripción o por inducción de metilación del DNA introducido, regulando con ello en sentido decreciente la actividad de transcripción en el transgén. Asimismo, el sitio de integración per se puede influir en el nivel de expresión del transgén. La combinación de estos factores da como resultado una gran variación en el nivel de expresión de los transgenes o DNA extraño de interés entre células de plantas y líneas de plantas transgénicas diferentes. Además, la integración del DNA extraño de interés puede tener un efecto disruptivo en la región del genoma en la que ocurre la integración, y puede influir o perturbar la función normal de dicha región diana, conduciendo con ello a efectos secundarios a menudo indeseables. Por esta razón, siempre que se investiga el efecto de introducción de un DNA extraño particular en una planta, se requiere que se generen y se analicen un gran número de líneas de plantas transgénicas a fin de obtener resultados significativos. Análogamente, en la generación de plantas de cosecha transgénicas, en las que se introduce un DNA de interés particular en las plantas para proporcionar a la planta transgénica un fenotipo deseado conocido, se crea una gran población de líneas de plantas transgénicas creadas independientemente o los denominados sucesos, para permitir la selección de aquellas líneas de plantas que exhiben una expresión óptima de los transgenes, y con efectos secundarios mínimos o inexistentes, en el fenotipo global de la planta transgénica. Particularmente en este campo, sería ventajoso si este proceso de tanteos pudiera reemplazarse por un método más directo, teniendo en cuenta los requisitos reguladores engorrosos y los costes elevados asociados con las pruebas en campo repetidas necesarias para la eliminación de los sucesos transgénicos no deseados. Adicionalmente, estará claro que la posibilidad de inserción de DNA direccionada podría ser también beneficiosa en el proceso de la denominada superposición de transgenes. La necesidad de controlar la integración del transgén en plantas ha sido pronto reconocida, y se han desarrollado varios métodos en un esfuerzo para satisfacer esta necesidad (para una revisión véase Kumar y Fladung, 2001, Trends in Plant Science, 6, p. 155-159). Estos métodos están basados fundamentalmente en integración de transgenes basada en recombinación homóloga, una estrategia que ha sido aplicada con éxito en procariotas y eucariotas inferiores (véase v.g. EP 0317509 o la publicación correspondiente por Paszkowski et al., 1988, EMBO J., 7, p. 4021-4026). Sin embargo, para las plantas, el mecanismo predominante para la integración de transgenes está basado en la recombinación ilegítima que implica poca homología entre las cadenas de DNA recombinantes. Un desafío importante en esta área es por consiguiente la detección de los sucesos raros de recombinación homóloga, que se ven enmascarados por la integración mucho más eficiente del DNA extraño introducido por recombinación ilegítima. Una forma de resolver este problema es por selección contra los sucesos de integración que se han producido por recombinación ilegítima, tal como se ilustra en WO 94/17176. Otra forma de resolver el problema por activación del locus diana y/o del DNA de reparación o donante por la inducción de roturas de DNA bicatenario por medio de endonucleasas de corte raro, tales como I-SceI. Se ha 2   demostrado que esta técnica aumenta la frecuencia de recombinación homóloga al menos en dos órdenes de magnitud utilizando Agrobacterias para suministrar el DNA de reparación a las células de las plantas (Puchta et al., 1996, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A., 93, p. 5055-5060; Chilton y Que, Plant Physiol., 2003). WO 96/14408 describe un DNA aislado que codifica la enzima I-SceI. Esta secuencia de DNA puede incorporarse en vectores de clonación y expresión, líneas de células transformadas y animales transgénicos. Los vectores son útiles en mapeado génico e inserción de genes dirigida al sitio. WO 00/46386 describe métodos de modificación, reparación, atenuación e inactivación de un gen u otro DNA cromosómico en una célula por rotura de las dobles cadenas con I-SceI. Se describen también métodos de tratamiento o profilaxis de una enfermedad genética en un individuo que se encuentra en necesidad de ello. Se describen adicionalmente endonucleasas de restricción quiméricas. Sin embargo, persiste todavía la necesidad de mejorar la frecuencia de la inserción direccionada de un DNA extraño en el genoma de una célula eucariota, particularmente en el genoma de una célula vegetal. Estos y otros problemas se resuelven como se describe más adelante en esta memoria en las diferentes realizaciones detalladas de la invención, así como en las reivindicaciones. Sumario de la invención En una realización, la invención proporciona un método para la introducción de un DNA extraño de interés, que puede estar flanqueado por una región de DNA que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una región de DNA que flanquea un sitio preseleccionado, en un sitio preseleccionado, tal como un sitio I-SceI de un genoma de una célula vegetal, tal como una célula de maíz, que comprende las etapas de (a) inducir una rotura de DNA bicatenario en el sitio preseleccionado en el genoma de la célula mediante introducción en dicha célula vegetal de un gen expresable en plantas que codifica una enzima que induce una rotura de DNA bicatenario de corte raro que reconoce dicho sitio preseleccionado, por ejemplo introduciendo un gen que codifica I-SceI; (b) introducir el DNA extraño de interés en la célula vegetal; caracterizado porque el DNA extraño se suministra mediante transferencia directa de DNA, que se puede lograr mediante bombardeo de microproyectiles revestidos con el DNA extraño de interés. El gen que codifica I-SceI puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 1, en el que dicha secuencia nucleotídica tiene un contenido de GC de alrededor de 50% a alrededor de 60%, con la condición de que i) la secuencia nucleotídica no comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en GATAAT, TATAAA, AATATA, AATATT, GATAAA, AATGAA, AATAAG, AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA y CATAAA; ii) el nucleótido no comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en CCAAT, ATTGG, GCAAT y ATTGC; iii) la secuencia nucleotídica no comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en ATTTA, AAGGT, AGGTA, GGTA o GCAGG; iv) la secuencia nucleotídica no comprende un tramo GC que consiste en 7 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo de G o... [Seguir leyendo]

1. Un método para introducir un DNA extraño de interés en un sitio preseleccionado de un genoma nuclear de una célula vegetal, que comprende las etapas de (a) inducir una rotura de DNA bicatenario en un sitio preseleccionado en dicho genoma nuclear mediante introducción en dicha célula vegetal de un gen expresable en plantas que codifica una enzima que induce una rotura de DNA bicatenario de corte raro que reconoce dicho sitio preseleccionado; (b) introducir el DNA extraño de interés en la célula vegetal mediante transferencia directa de DNA. 2. El método según la reivindicación 1, en el que dicha enzima que induce una rotura de DNA bicatenario comprende una señal de localización nuclear. 3. El método según las reivindicaciones 1 y 2, en el que dicha enzima que induce una rotura de DNA bicatenario es la endonucleasa I-SceI. 4. El método según las reivindicaciones 1-3, en el que dicha transferencia directa de DNA se logra por bombardeo de microproyectiles recubiertos con el DNA extraño de interés. 5. El método según las reivindicaciones 1-3, en el que dicha transferencia directa de DNA se logra mediante introducción de DNA por electroporación en protoplastos. 6. El método según las reivindicaciones 1-3, en el que dicha transferencia directa de DNA se logra mediante introducción de DNA por electroporación en células vegetales intactas o tejidos o células vegetales parcialmente degradados. 7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho DNA extraño de interés está flanqueado por una región de DNA que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una región de DNA que flanquea el sitio preseleccionado. 8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, por el cual la célula vegetal es una célula de maíz. 9. El método de la reivindicación 8, en el que la célula de maíz está comprendida en una suspensión celular. 10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, por el cual dicha célula vegetal se incuba en un compuesto fenólico vegetal antes de la etapa (a). 11. El método de la reivindicación 10, en el que dicho compuesto fenólico vegetal es acetosiringona. 83   84