Inmunoglobulinas humanizadas y su producción.

Un método de producción de una inmunoglobulina humanizada que tieneuna región de marco aceptora humana y regiones determinantes decomplementariedad (RDC) Kabat de una inmunoglobulina donante,

dondedicha inmunoglobulina humanizada se une a un antígeno, y donde dichométodo comprende la sustitución de al menos tres aminoácidos no RDC de laregión de marco de la cadena pesada con los correspondientes aminoácidosde la inmunoglobulina donante, en las posiciones donde:

(a) el aminoácido en la región de marco aceptora es raro para dicha posicióny el aminoácido correspondiente en la región de marco donante es comúnpara dicha posición en secuencias de inmunoglobulina humana; o

(b) el aminoácido es adyacente a uno de las RDC; o

(c) el aminoácido se predice que tiene un átomo de cadena lateral capaz deinteraccionar con las RDC de la inmunoglobulina humanizada.

Campo de la invención La presente invención se refiere generalmente a la combinación de tecnologías de ADN recombinante y anticuerpos monoclonales para desarrollar nuevos agentes terapéuticos y, más particularmente, a la producción de anticuerpos no inmunógenos.

Fundamentos de la invención En los mamíferos, la respuesta inmune está mediada por dos tipos de células que interaccionan específicamente con material extraño, es decir, antígenos. Uno de estos tipos de células, las células B, son responsables de la producción de anticuerpos. La segunda clase de células, las células T, incluyen una gran diversidad de subconjuntos celulares que controlan la función in vivo tanto de las células B como de una gran diversidad de otras células hematopoyéticas, con inclusión de las células T.

Una manera en la que las células T ejercen este control es mediante la producción de una linfocina conocida como interleuquina-2 (IL-2) , denominada originalmente factor de crecimiento de las células T. La función primaria de IL-2 parece ser la estimulación y el mantenimiento de las células T. De hecho, algunos inmunólogos creen que IL-2 puede encontrarse en el centro de la respuesta inmune completa (véase, Farrar, J., y col., Immunol. Rev. 63: 129-166 (1982) , que se incorpora el presente documento por referencia) .

Para ejercer sus efectos biológicos, IL-2 interacciona con un receptor de membrana específico de alta afinidad (Greene,

W. y col., Progress in Hematology XIV, E. Brown, compilador, Grune y Statton, Nueva York (1986) , en las páginas 283 y siguientes) . El receptor de IL-2 humana es una glicoproteína compleja de cadenas múltiples, teniendo una de las cadenas, conocida como el péptido Tac, aproximadamente 55 kD de tamaño (véase, Leonard, W., y col., J. Biol. Chem., 260: 1872 (1985) . Se ha aislado un gen que codifica esta proteína, y predice un péptido de 272 aminoácidos, con inclusión de un péptido de señal de 21 aminoácidos (véase, Leonard, W., y col., Nature 311: 626 (1984) ) . Los 219 aminoácidos del terminal NH2 de la proteína p55 Tac comprenden aparentemente un dominio extracelular (véase, Leonard, W., y col., Science,

230: 633-639 (1985) , que se incorpora el presente documento por referencia) .

Gran parte de la dilucidación de la estructura y función del receptor de IL-2 humana y su función se debe al desarrollo de anticuerpos monoclonales específicamente reactivos. En particular, un anticuerpo monoclonal de ratón, conocido como anti-Tac (Uchiyama, y col., J. Immunol. 126: 1393 (1981) ) ha demostrado que se pueden detectar detectores de IL-2 en las células T, pero también en células de la familia monocitos-macrófagos, células Kupffer del hígado, células Langerhans de la piel y, por supuesto, células T activadas. Es importante que las células T inactivas, las células B o los macrófagos circulantes no presentan típicamente el receptor de IL-2 (Herrmann y col., J. Exp. Med. 162: 1111 (1985) ) .

El anticuerpo monoclonal anti-Tac se ha utilizado también para definir funciones de los linfocitos que requieren interacción con IL-2 y se ha demostrado que inhibe diversas funciones de las células T, con inclusión de la generación de linfocitos T citotóxicos y supresores en la estructura de la célula. Asimismo, sobre la base de estudios con anti-Tac y otros anticuerpos, se asocian actualmente una diversidad de trastornos con la expresión impropia de receptor de IL-2 por las células T, en particular la leucemia de las células T de los adultos.

Más recientemente, se ha demostrado que el receptor de IL-2 es una diana ideal para nuevos enfoques terapéuticos a las enfermedades mediadas por las células T. Se ha propuesto que anticuerpos específicos del receptor de IL-2, tales como el anticuerpo monoclonal anti-Tac, se pueden utilizar sea solos o como un inmunoconjugado (p.ej., con Ricina A, isótopos y análogos) para separar eficazmente las células que llevan el receptor de IL-2. Estos agentes pueden, por ejemplo, eliminar teóricamente las células leucémicas que expresan el receptor de IL-2, ciertas células B, o células T activadas implicadas en un estado de enfermedad, y permitir sin embargo la retención de las células T normales maduras y sus precursores para asegurar la capacidad de montar una respuesta inmune de las células T normales en caso necesario. En general, la mayoría de otros agentes específicos de las células T pueden destruir esencialmente todas las células T periféricas, lo cual limita la eficacia terapéutica de los agentes. Globalmente, el uso de anticuerpos monoclonales apropiados específicos para el receptor de IL-2 puede tener utilidad terapéutica en enfermedades autoinmunes, trasplantes de órganos y cualquier respuesta no deseada por las células T activadas. De hecho, se han iniciado pruebas clínicas utilizando, p.ej., anticuerpos anti-Tac (véase, en general, Waldman, T., y col., Cancer Res. 45: 625 (1985) y Waldman, T., Science 232: 727-732 (1986) ) .

Desafortunadamente, el uso del anticuerpo anti-Tac y otros anticuerpos monoclonales no humanos presentan ciertos inconvenientes, en particular en regímenes terapéuticos repetidos como se explica más adelante. Los anticuerpos monoclonales de ratón, por ejemplo, no fijan bien el complemento humano, y carecen de otras características funcionales importantes de inmunoglobulinas cuando se utilizan en seres humanos.

Quizás de manera más importante, el anticuerpo anti-Tac y otros anticuerpos monoclonales no humanos contienen tramos sustanciales de secuencias de aminoácidos que serán inmunógenos cuando se inyectan a un paciente humano. Numerosos estudios han demostrado que, después de la inyección de un anticuerpo extraño, la respuesta inmune provocada por un paciente contra un anticuerpo puede ser muy fuerte, eliminando esencialmente la utilidad terapéutica del anticuerpo después de un tratamiento inicial. Además, dado que puede esperarse que se desarrollen números crecientes de anticuerpos monoclonales diferentes de ratón u otros antígenos (para los seres humanos) para tratar diversas enfermedades, después de los tratamientos primero y segundo con cualesquiera anticuerpos no humanos diferentes, los tratamientos subsiguientes incluso para terapias no semejantes pueden ser ineficaces o incluso peligrosos en sí mismos.

Si bien la producción de los denominados "anticuerpos quiméricos" (p.ej., regiones variables de ratón unidas a regiones constantes humanas) (véase, por ejemplo, el documento WO89/09622) ha alcanzado un éxito relativo, persiste un problema importante de inmunogenicidad. En general, la producción de inmunoglobulinas humanas reactivas con el receptor de IL-2 humana, como con muchos antígenos humanos, ha resultado extremadamente difícil utilizando técnicas de producción de anticuerpos monoclonales humanos típicas. Análogamente, los intentos pasados que utilizan tecnología de ADN recombinante para producir los denominados anticuerpos "humanizados" (véase p.ej., la publicación EPO No. 0239400) , proporcionan resultados inciertos, debido en parte a afinidades de fijación no predecibles.

Así pues, existe necesidad de formas mejoradas de inmunoglobulinas análogas a las humanas, tales como las específicas para el receptor de IL-2 humana, que sean sustancialmente no inmunógenas en seres humanos y que, sin embargo, se produzcan fácil y económicamente de una manera adecuada para formulación terapéutica y otros usos. La presente invención satisface estas y otras necesidades. Las regiones hipervariables (denominadas también Regiones Determinantes de la Complementariedad, abreviado a "CDR") de las inmunoglobulinas fueron definidas originalmente por Kabat y col. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E., y col., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, (1983) ) sobre la base de la extensión de la variabilidad de secuencia, indicándose que están constituidas por los restos 24-34 (L1) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera, (VL) y 3135 (H1) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el domino variable de la cadena pesada (VH) , utilizando el sistema de numeración estándar de Kabat para aminoácidos de anticuerpos. Se cree que las CDR se ponen en contacto con el antígeno diana de un anticuerpo y son fundamentalmente responsables de la fijación. Más recientemente, Chothia y col. (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987) ) han dado una definición alternativa de las regiones hipervariables o CDR afirmando que están constituidas por los restos 26-32 (L1) , 50-52 (L2) , 91-96 (L3) en VL y los restos 26-32 (H1) , 53-55 (H2) , 96-101 (H3) en VH. La definición de Chothia está basada en los restos que constituyen los anillos en las estructuras de tres dimensiones... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de una inmunoglobulina humanizada que tiene una región de marco aceptora humana y regiones determinantes de complementariedad (RDC) de Kabat de una inmunoglobulina donante, inmunoglobulina humanizada que se une a un antígeno, comprendiendo dicho procedimiento la sustitución de más de tres aminoácidos no RDC del marco de la cadena pesada aceptora con los correspondientes aminoácidos de la inmunoglobulina donante, en posiciones en las que:

(a) el aminoácido en la región de marco aceptora es raro para dicha posición y el aminoácido correspondiente en la región de marco donante es común para dicha posición en secuencias de inmunoglobulina humana; o

(b) el aminoácido es inmediatamente adyacente a una de las RDC; o

(c) se predice que el aminoácido tiene un átomo de cadena lateral capaz de interaccionar con las RDC de la inmunoglobulina humanizada.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que dicha inmunoglobulina humanizada tiene una afinidad de unión por el antígeno de 108 M-1 o mayor.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o 2 en el que dicha inmunoglobulina humanizada es un tetrámero de anticuerpo compuesto por un par idéntico de polipéptidos de cadena pesada y un par idéntico de polipéptidos de cadena ligera.

4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende además purificar dicha inmunoglobulina humanizada.

5. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha inmunoglobulina donante es una inmunoglobulina de ratón.

6. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha inmunoglobulina humanizada tiene una región constante de región ligera codificada por un gen de región constante kappa o lambda.

7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha inmunoglobulina humanizada tiene una región constante de cadena pesada codificada por un gen de región constante alfa, gamma, delta, epsilon o mu.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha región constante de cadena pesada está codificada por un gen gamma-1 de inmunoglobulina humana.

9. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha inmunoglobulina humanizada destruye células diana mediante citotoxicidad dependiente de complemento o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo.

10. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se usa la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) para expresar y producir dicha inmunoglobulina humanizada.

11. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha inmunoglobulina humanizada es útil para administración subcutánea, intramuscular o intravenosa.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha inmunoglobulina humanizada se disuelve en un vehículo acuoso.