INMUNOGLOBULINAS DESPROVISTAS DE CADENAS LIGERAS.

Un fragmento polipeptídico que comprende un dominio variable de una inmunoglobulina que comprende dos cadenas de polipéptido pesadas y está desprovista de cadenas ligeras,

obteniéndose dicha inmunoglobulina a partir de Camélidos, en donde cada cadena de polipéptido pesada es capaz de reconocer y fijar un antígeno, en donde el fragmento tiene una región marco 2 (FR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre WFREGPG KEREGIA, y WYRQAPGKEREFVS

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E05008358.

Solicitante: VRIJE UNIVERSITEIT BRUSSEL.

Nacionalidad solicitante: Bélgica.

Dirección: PLEINLAAN 2,1050 BRUSSEL.

Inventor/es: HAMERS, RAYMOND, CASTERMAN, CECILE.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 18 de Agosto de 1993.

Fecha Concesión Europea: 23 de Diciembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K16/00 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales.
  • C07K16/20 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › de protozoos.

Clasificación PCT:

  • C12N15/13 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Inmunoglobulinas.
  • G01N33/53 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.

Clasificación antigua:

  • C12N15/13 C12N 15/00 […] › Inmunoglobulinas.
  • G01N33/53 G01N 33/00 […] › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda.


Fragmento de la descripción:

Inmunoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras.

La invención se refiere a nuevas inmunoglobulinas aisladas que están desprovistas de cadenas polipeptídicas ligeras. Estas inmunoglobulinas no consisten en los productos de degradación de las inmunoglobulinas compuestas tanto de cadenas polipeptídicas pesadas como de cadenas polipeptídicas ligeras, sino que por el contrario, la invención define un nuevo miembro de la familia de las inmunoglobulinas, especialmente un nuevo tipo de moléculas capaces de estar implicadas en el reconocimiento inmune. Tales inmunoglobulinas pueden usarse para varios propósitos, especialmente para propósitos de diagnóstico o terapéuticos, incluyendo la protección frente a los agentes patológicos o la regulación de la expresión o la actividad de las proteínas.

Hasta ahora, la estructura propuesta para las inmunoglobulinas consiste en un modelo de cuatro cadenas que se refiere a la presencia de dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas (cadenas ligeras) y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas (cadenas pesadas) unidas mediante puentes disulfuro para formar macromoléculas con forma de Y o de T. Estas cadenas están compuestas por una región constante y una región variable, estando la región constante subdividida en varios dominios. Las dos cadenas polipeptídicas pesadas se unen normalmente mediante puentes disulfuro en una denominada "región bisagra" situada entre el primer y segundo dominios de la región constante.

Entre las proteínas que forman la clase de las inmunoglobulinas, la mayoría de ellas son anticuerpos y en consecuencia, presentan un sitio de unión al antígeno o varios sitios de unión al antígeno.

Según el modelo de cuatro cadenas, el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo se localiza en los dominios variables de cada una de las cadenas pesada y ligera y requiere la asociación de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera.

Para la definición de estas inmunoglobulinas de modelo de cuatro cadenas, se hace referencia a Roitt. 1 et al. (Immunology-second-Edition Gower Medical Publishing USA, 1989). La referencia se hace especialmente a la parte concerniente a la definición de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas, a sus estructuras polipeptídicas y genéticas, a la definición de sus regiones variables y constantes y a la obtención de los fragmentos producidos por la degradación enzimática según técnicas bien conocidas.

Los inventores han establecido sorprendentemente que pueden aislarse moléculas diferentes a partir de animales que las producen naturalmente, moléculas que tienen propiedades funcionales de inmunoglobulinas, estando esas funciones relacionadas en algunos casos con elementos estructurales que son distintos de los implicados en la función de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas debido, por ejemplo, a la ausencia de cadenas ligeras.

La invención se refiere a inmunoglobulinas del modelo de dos cadenas que no corresponden ni con los fragmentos obtenidos por ejemplo mediante la degradación, en particular la degradación enzimática, de una inmunoglobulina del modelo de cuatro cadenas, ni corresponde con la expresión en las células huésped del ADN que codifica para la región constante o la variable de una inmunoglobulina natural del modelo de cuatro cadenas o con una parte de estas regiones, ni corresponde con los anticuerpos producidos en las linfopatías, por ejemplo, en ratones, ratones, ratas o humanos.

E.S. Ward et al. (1) ha descrito algunos experimentos realizados en los dominios variables de las cadenas polipeptídicas pesadas (VH) o/y en las cadenas polipeptídicas ligeras (VK/Fv) para probar la capacidad de estos dominios variables para unir antígenos específicos. Para este propósito, se preparó una librería de genes VH a partir del ADN genómico del bazo del ratón inmunizado previamente con estos antígenos específicos.

Ward et al han descrito en su publicación que los dominios VH son relativamente adhesivos, presumiblemente debido a la superficie hidrófoba expuesta, normalmente tapada por los dominios VK o V?. Por consiguiente, ellos se imaginaron que debería ser posible diseñar dominios VH que tuvieran propiedades mejoradas y además, que los dominios VH con actividades de unión pudieran servir como los componentes básicos para fabricar fragmentos variables (fragmentos FV,) o anticuerpos completos.

La publicación de Blier P.R. et al (The Journal of Immunology, vol. 139, 3996-4006, nº 12, 15 de diciembre de 1987) describe secuencias de nucleótidos incompletas obtenidas a partir de hibridomas.

La invención no parte de la idea de que los diferentes fragmentos (cadenas ligeras y pesadas) y los diferentes dominios de estos fragmentos de la inmunoglobulina del modelo de cuatro cadenas pueda modificarse para definir sitios de unión al antígeno nuevos o mejorados o una inmunoglobulina del modelo de cuatro cadenas.

Los inventores han determinado que las inmunoglobulinas pueden tener una estructura diferente al modelo conocido de cuatro cadenas y que tales inmunoglobulinas diferentes ofrecen nuevos medios para la preparación de reactivas de diagnóstico, agentes terapéuticos o cualquier otro reactivo para su uso en investigación o para propósitos industriales.

Por tanto, la solicitud describe nuevas inmunoglobulinas que son capaces de mostrar propiedades funcionales de las inmunoglobulinas del modelo de cuatro cadenas, aunque su estructura parezca ser más apropiada en muchas circunstancias para su uso, su preparación y en algunos casos, para su modificación. Además, estas moléculas pueden considerarse como estructuras principales para la modificación de otras inmunoglobulinas. Las ventajas proporcionadas por estas inmunoglobulinas comprenden la posibilidad de prepararlas con una mayor facilidad.

De acuerdo con esto, la invención describe inmunoglobulinas caracterizadas porque comprenden dos cadenas polipeptídicas pesadas suficientes para la formación de un sitio completo de unión al antígeno o de varios sitios de unión al antígeno, estando además estas inmunoglobulinas desprovistas de cadenas polipeptídicas ligeras. Estas inmunoglobulinas se caracterizan además por el hecho de que son el producto de la expresión en una célula huésped procariótica o eucariótica, de un ADN o de un ADNc que tiene la secuencia de una inmunoglobulina desprovista de cadenas ligeras, obtenible a partir de linfocitos o de otras células de camélidos.

Las inmunoglobulinas descritas pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de las secuencias que se describen en la figura 7.

Las inmunoglobulinas descritas, que están desprovistas de cadenas ligeras, están de manera que los dominios variables de sus cadenas pesadas tengan propiedades que difieren de las de los VH de la inmunoglobulina de cuatro cadenas. El dominio variable de una inmunoglobulina de cadena pesada de la invención no tiene sitios de interacción normales con el dominio VI, ni con el CH1 que no existe en las inmunoglobulinas de cadena pesada. Por lo tanto, es un fragmento novedoso en muchas de sus propiedades, tal como la solubilidad y la posición del sitio de unión. Por razones de claridad, lo llamaremos VHH en este texto para distinguirlo de los VH clásicos de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas.

Por "un sitio de unión al antígeno completo" se quiere decir, de acuerdo con la invención, un sitio que permitirá por sí solo el reconocimiento y la unión completa de un antígeno. Esto podría verificarse mediante cualquier método conocido con respecto a los ensayos de la afinidad de la unión.

Estas inmunoglobulinas que pueden ser preparadas mediante la técnica de ADN recombinante, o aisladas de animales, algunas veces serán denominadas "inmunoglobulinas de cadenas pesadas" en las siguientes páginas. Preferiblemente estas inmunoglobulinas están en una forma pura.

Las inmunoglobulinas descritas son obtenidas en células procarióticas, especialmente en células de E. coli por un proceso que comprende los pasos de:

a) clonar en un vector Bluescript una secuencia de ADN o ADNc que codifica para el dominio VHH de una inmunoglobulina desprovista de cadena ligera obtenida por ejemplo a partir de linfocitos o Camellos,
b) recuperar el fragmento clonado después de la amplificación usando un cebador 5' que contiene un sitio Xho y un cebador...

 


Reivindicaciones:

1. Un fragmento polipeptídico que comprende un dominio variable de una inmunoglobulina que comprende dos cadenas de polipéptido pesadas y está desprovista de cadenas ligeras, obteniéndose dicha inmunoglobulina a partir de Camélidos, en donde cada cadena de polipéptido pesada es capaz de reconocer y fijar un antígeno, en donde el fragmento tiene una región marco 2 (FR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre WFREGPG KEREGIA, y WYRQAPGKEREFVS.

2. Un fragmento polipeptídico que comprende un dominio variable de una inmunoglobulina que comprende dos cadenas polipeptídicas pesadas y está desprovista de cadenas ligeras, en donde cada una de las cadenas de polipéptido pesadas es capaz de reconocer y fijar un antígeno, en donde el fragmento tiene una región marco 4 (FR4) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de:

3. Un fragmento polipeptídico de inmunoglobulina humanizado que contiene un sitio de fijación de antígeno y que comprende un dominio variable de una inmunoglobulina que comprende dos cadenas de polipéptido pesadas y está desprovista de cadenas ligeras, originándose dicha inmunoglobulina a partir de un Camélido, en donde en dicho fragmento polipeptídico, los residuos de aminoácidos de la región marco de dicho dominio variable están reemplazados por residuos marco humanos.

4. Un fragmento polipeptídico humanizado que contiene un sitio de fijación de antígeno y que comprende un dominio variable de una inmunoglobulina que comprende dos cadenas de polipéptido pesadas y está desprovista de cadenas ligeras, originándose dicha inmunoglobulina a partir de un Camélido, en donde dicho fragmento polipeptídico comprende un dominio variable de dicha cadena polipeptídica pesada, enlazada a la totalidad o parte de la región constante de un anticuerpo humano.

5. Anticuerpo que es expresado por dos genes clonados serialmente que corresponden a los dominios variables VHH de una inmunoglobulina que comprende dos cadenas de polipéptido pesadas y que se obtiene de Camélidos en donde dichas cadenas de polipéptido pesadas son capaces de reconocer y fijar un antígeno, anticuerpo que es heteroespecífico y comprende fragmentos VHH expresados que tienen especificidades diferentes.

6. Anticuerpo multifuncional de acuerdo con la reivindicación 5, que es un anticuerpo bifuncional.

7. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5, que es heteroespecífico y adecuado para direccionamiento de una sustancia biológica o un fármaco.

8. Un fragmento o un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que se expresa en una célula hospedadora.

9. Un fragmento polipeptídico o un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es sintetizado.

10. Un fragmento polipeptídico o un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que fija específicamente una proteína, hapteno, carbohidrato o ácido nucleico.

11. Un fragmento polipeptídico o un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que tiene actividad catalítica.

12. Un fragmento polipeptídico o un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que está conjugado con una toxina, una enzima, un fármaco o una hormona.


 

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