Inmunoensayo de zolpidem con ventana de detección extendida.

Un inmunógeno de la estructura**Fórmula**

en donde

accm es un material transportador que confiere antigenicidad; n≥ 0 ó 1; X es un heteroátomo

, preferiblemente nitrógeno, oxígeno o azufre; Y es un resto arileno o alquileno de cadena lineal, sustituido o sin sustituir, de C1-10, preferiblemente de C2-6; Z es, antes de la conjugación con el accm, carboxi, ditiopiridilo, maleimida, amino, hidroxílo, tiol, tioéster o un resto aldehído.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10152365.

Solicitante: RANDOX LABORATORIES LTD..

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: Ardmore, 55 Diamond Road Crumlin, County Antrim BT29 4QY REINO UNIDO.

Inventor/es: BENCHIKH,ELOUARD, FITZGERALD,PETER, LOWRY,PHILIP, MCCONNELL,IVAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/94 (en los que intervienen narcóticos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/44 (contra material no previsto)

PDF original: ES-2523896_T3.pdf

 

google+ twitter facebookPin it
Inmunoensayo de zolpidem con ventana de detección extendida.
Inmunoensayo de zolpidem con ventana de detección extendida.
Inmunoensayo de zolpidem con ventana de detección extendida.

Fragmento de la descripción:

Inmunoensayo con zolpiden con ventana de detección extendida Antecedentes de la invención El zolpidem, de nombre istemático N, N-dimetil-2[-6-metil-2- (4-metilfenil) imidazo[1, 2-a]piridina-3-il]acetamida, es un fármaco prescrito con frecuencia para combatir los trastornos neurológicos y del sueño, especialmente el insomnio. El fármaco está clasificado como un hipnótico no benzociiazepínico, y actúa sobre los receptores del ácido aminobutírico gabba. Tras su ingestión, el zolpidem actúa rápidamente y tiene una vida media de 1, 5 a 3 h. El metabolismo se lleva a cabo gracias al citocromo P450, produciendo más del 80 % del ácido 4-[3- (2-N, Ndimetilamino-2-oxoetil) -6-metilimidazo-[1, 2-a]piridina-2-il] benzoico (M1) , formado a través del correspondiente metabolito hidroxi y una cantidad relativamente pequeña de ácido 3- (2-N, N-dimetilamino-2-oxoetil) -2-{4metilfenil) imidazo[1, 2-a]piridin-6-il carboxílico (1-4) . A pesar de su eficacia terapéutica demostrada han aumentado las denuncias por problemas de dependencia y abuso para fines delictivos y estimulantes (5-7) y de los efectos secundarios que amenazan la vida debido por las alucinaciones que provoca y porque afecta a la conducción (8) . Villain et al (9) informó de que el zolpidem ocupaba el primer lugar en una lista de fármacos utilizados en agresiones sexuales facilitadas por fármacos. Este potencial de abusos o sucesos adversos en individuos que lo toman o ue tienen acceso a zolpidem crea una necesidad de que se lleve a cabo una toxicología clínica y forense para su detección y/o determinación, utilizando métodos analíticos prácticos y asequibles. Los métodos analíticos que se han utilizado para detectar e identificar el zolpidem incluyen HPLC, LC-MS-MS, GC y GC-MS. Un método de HPLC con columnas de conmutación, complejo, que emplea un gran equipo técnico y que incorpora una fase de limpieza y de preconcentración con M1 como marcador de sobredosis, ya que es el marcador de zolpidem más abundante en plasma y orina (1) . Se describe un método GC-MS que implica la extracción de la muestra y una derivatización del compuesto para detectar el M1 en un plazo máximo de 72 horas en dos casos de presunta agresión facilitada por fármacos con zolpidem (10) . El inmunoensayo más económico y más práctico también se ha empleado para detectar y cuantificar el zolpidem. El inmunoensayo presenta muchas ventajas respecto a otros formatos analíticos habituales, como la GC-MS y la LC-MS en cuanto a costes, facilidad de uso y su flexibilidad para fabricarse en un formato portátil y compacto para su uso en el terreno. Se han descrito un radioinmunoensayo (RIA) y un ensayo de tipo EMIT. El RIA describe un inmunógeno en el que el agente de reticulación de proteínas se incorpora en la posición 3 del heterociclo condensado, detectándose así el zolpidem, sin que se haya informado de ningún tipo de reactividad cruzada con los metabolitos (11) . El RIA es extremadamente sensible, pero lleva asociados factores de salud y seguridad. Por lo general, los RIA tienen poca aceptación comercial y los inventores desconocen que exista un RIA para zopidelm. Existe un kit disponible en el mercado para la detección forense de zolpidem en sangre entera, suero y orina, con un valor umbral de detección de 25 ng/ml (prospecto de inmunoanálisis ELISA de zolpidem, catálogo 233) . Se ha informado de que el kit no detecta M1 a 1000 ng/ml (8) . En un inmunoensayo de seguimiento desarrollado por la misma compañía para la detección de zolpidem en la orina se observa un límite de detección de 5 ng/ml y una ventana de detección de ocho horas en una persona descrita como consumidora no frecuente; transcurridas 16 horas, el zolpidem no se pudo detectar (12) . Un kit ELISA comercial fabricado por International Diagnostic Systems detecta zolpidem a 75 ng/ml. Ninguno de los kits notificó la detección de M1.

Lamont (13) describió un anticuerpo y un inmunoensayo sensible a zolpidem que no poseía reactividad cruzada con M1.

Debido a que el metabolismo del zolpidem es rápido y varía entre distintas personas (8, 9, 12) , los presentes immunoensayos detectan únicamente la molécula original no tienen la sensibilidad suficiente para poder utilizarse de forma fiable como herramienta para detectar el uso indebido de zolpidem o de estar conduciendo bajo sus efectos en muestras de pacientes que se recogieron aproximadamente más allá de 8-24 horas. Para resolver esta incompatibilidad, los inventores idearon y diseñaron un inmunoensayo basado en la detección del zolpidem y su metabolíto principal M1. La presente invención permite la detección y determinación inmunosensible del zolpidem y de su metabolíto principal en muestras de pacientes y extiende el periodo de tiempo de detección del zolpidem en el que puede ser detectado tras su ingestión.

Bibliografía

1. Ascalone V. et al. (1992;. J. Chromatogr. 581: 237-250

2. Hempel G. y Blaschke G. (1996) . J. Chromatogr, B 675:131-137

3. von Moltke L. et al. (1999) . Br. J. Clin, Pharmacol. 48: 89-97

4. Salva P. y Costa J. (1995) . Clin Pharmacokin. 29:142-153

5. Madea B. y Muβhoff F. (2009) . Dtsch. Autebl. Int. 106:341-347

6. Maravelias C et al. (2009) . Am. J. Forensic Med. Pathol 30: 384-385

7. Victorri-Vigneau C. et al. (2007) . Br. J. Clin. Pharmacol. 64:198-209

8. Reidy L. et al (2008) . J. Anal. Tox. 32: 688-694

9. Villain M. et al. (2004) . Forensic Sci, Int. 143:157-161

10. Lewis J. y Vin J. (2007) . J. Anal. Tox. 31:195-199

11. DeClerck l. y Daenens P. (1997) . The Analyst 122:1119-1124

12. Huynh K. et al. SOFT 2009, October 19-23 2009, Oklahoma, Program and Abstracts

13. Lamont J.V. (2009) , Animal meeting of the AACC Clinical Chemistr y , vol. 55, nº 6, Suppl. S, página A250.

Compendio de la invención No existe ningún inmunoensayo pata la detección y determinación de zolpidem en muestras in vitro de pacientes que tenga una ventana de detección extendida. La presente invención proporciona una disolución a este problema. La invención emplea un anticuerpo único y de gran sensibilidad que se une al zolpidem y a su metabolito principal, el ácido 4-[3- (2-N, N dimetilamino-2-oxoetil) -6-metilimidazo[1, 2-a]piridin-2-il] benzoico. La identificación del ácido 4- (3 (2-N, N-dimetilamino-2-oxoetil) -6-metilimidazo[1, 2-a]piridin-2-il] benzoico por el anticuerpo de gran sensibilidad de la invención permite métodos y kits para detectar e identificar el zolpidem que poseen una ventana de detección más amplia en comparación con otros inmunoensayos. Estos métodos y kits pueden utilizarse, por ejemplo, en casos de detección toxicológica y de violación facilitada por fármacos.

Dibujos Figura 1 Síntesis de hapteno I

Figura 2 Síntesis de hapteno II

Figura 3 Curvas de concentración-respuesta de anticuerpos para el zolpidem, su metabolito principal y analitos relacionados estructuralmente.

Exposición detallada de la invención Un primer aspecto de la invención es un inmunógeno de la estructura Estructura I

** (Ver fórmula) **

Estructura I

Donde -X-Y-Z es un agente de reticulación, n=0 ó 1 y accm es un material portador que confiere antigenicidad. En caso de estar presente, el agente de reticulación une el grupo carbonilo del anillo fenilo al accm. X es un heteroátomo, preferiblemente nitrógeno, oxígeno o azufre; Y es un resto arileno o un resto alquileno de C1-C10, más preferiblemente de C2-C6, de cadena lineal, sustituido o sin sustituir; Z (antes de la conjugación con el accm) se selecciona a partir de un resto carboxi, un ditiopiridilo, una maleimida, un amino, un hidroxiio, un tiol, un tioéster o un aldehído, más preferiblemente un resto carboxi. El inmunógeno preferido de la invención es cuando n=0. El accm puede ser cualquier material que haga... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un inmunógeno de la estructura

** (Ver fórmula) **

en donde

accm es un material transportador que confiere antigenicidad; n= 0 ó 1; X es un heteroátomo, preferiblemente nitrógeno, oxígeno o azufre; Y es un resto arileno o alquileno de cadena lineal, sustituido o sin sustituir, de C1-10, preferiblemente de C2-6; Z es, antes de la conjugación con el accm, carboxi, ditiopiridilo, maleimida, amino, hidroxílo, tiol, tioéster o un resto aldehído.

2. Un anticuerpo generado contra un inmunógeno de la reivindicación 1 que es específico para un epítopo de zolpidem y que presenta reactividad cruzada a un epítopo de ácido 4-[3- (2-N, N-dimetilamÃ?no-2-oxoetil) -6metilímidazo[1, 2-a]piridin-2-il] benzoico.

3.El anticuerpo de la reivindicación 2 cuya reactividad cruzada con el ácido 4-[3- (2-N, N-dimetilamino-2-oxoetil) ) -6metilimidazo[1, 2-a]piridina-2-il]benzoico es mayor que 5 %, preferiblemente mayor que 10 % y aún más preferiblemente mayor que 15%.

4. Un método de detección o identificación del zolpidem o del ácido 4-[3- (2-N, N-dimetilamino 2-oxoetil) -6metilitnidazo[1, 2-a]piridin-2-il]benzoico en una disolución de una muestra in vitro tomada de un paciente; comprendiendo el método en poner en contacto la muestra con el anticuerpo de las reivindicaciones 2 o 3 con un conjugado, midiendo el conjugado y deduciendo a partir de un calibrador la presencia o cantidad de zolpidem o del ácido 4-[3- (2-N, N-dimetilamino-2-oxoetil) -6-metilimidazo[1, 2-a]piridin-2-il]benzoico.

5. Un kit para detectar o identificar el zolpidem o el ácido 4- (3- (2-N, N dimetilamino-2-oxoetil) -6-metilimidazo[1, 2a]piridin-2-il]benzoico que comprende un anticuerpo de las reivindicaciones 2 o 3.

6. El kit de la reivindicación 5 que también comprende un conjugado y/o un calibrador.

7. El anticuerpo descrito en cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, que es un anticuerpo policlonal.