INHIBIDORES DE PROTEINAS DE LA FAMILIA RHO-GEF.

Polipéptido, caracterizado porque:

- comprende o está constituido por la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2,

correspondiente a la secuencia de TRIPa, o

- comprende o está constituido por la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 4, correspondiente a la secuencia de TRIPa, o

- está constituido por la secuencia de aminoácidos de cualquier secuencia derivada de la secuencia SEC ID nº 4 mediante sustitución de uno o más aminoácidos, con la condición de que dicha secuencia derivada inhiba TrioGEFD2,

siendo dicha secuencia SEC ID nº 4 la secuencia siguiente:

AREGADGAICGYNLATLVMLGPSERVFCPLCEPCSSDIYELM

en la que:

• los residuos en negrita representan los residuos esenciales para la inhibición de la actividad de TrioGEFD2,

• los residuos subrayados representan los residuos no esenciales para la inhibición de la actividad de TrioGEFD2, y

• los residuos no en negrita y no subrayados representan los residuos no sometidos a ensayo para la inhibición de la actividad de TrioGEFD2

Inhibidores de proteínas de la familia Rho-GEF.

La presente invención se refiere a inhibidores de proteínas de la familia de Rho-GEF.

La presente invención se refiere asimismo a inhibidores de la proteína Trio, y a las secuencias de nucleótidos correspondientes. La presente invención se refiere asimismo a la utilización de dichos inhibidores en la preparación de fármacos.

Las Rho-GTPasas son interruptores moleculares que controlan las modificaciones del citoesqueleto de actina durante la proliferación, transformación, migración celular y morfogénesis (Hall A., 1998). Siguen un ciclo entre una forma inactiva unida a GDP y una forma activa unida a GTP. Los factores de intercambio de nucleótido guanina (Rho-GEF) aceleran su intercambio GDP/GTP, activando la GTPasa (Boguski et al., 1993). La gran familia de Rho-GEF, al igual que sus dianas GTPasa, ha sido implicada en una diversidad de procesos celulares: se han identificado varios elementos de la familia de Rho-GEF basándose en sus propiedades oncogénicas, y numerosos informes sugieren que también participan en la morfología neuronal (Stam et al., 1999).

Los Rho-GEF habitualmente comparten una región catalítica conservada denominada dominio DH (por "homología de Dbl") en referencia al oncogén Dbl, que fue uno de los primeros Rho-GEF identificados (Hart et al., 1994).

Una proteína compleja denominada Trio, aislada por su capacidad de unirse a la tirosina fosfatasa transmembranal LAR, es una proteína que contiene dos dominios Rho-GEF y un dominio serina quinasa, repeticiones espectrina, SH3 y un dominio similar a la inmunoglobulina (Debant et al., 1996). El primer dominio Rho-GEF (TrioGEFD1) activa a RhoG (Blangy et al., 2000) que, a su vez, activa a Rac y a Cdc42 y estimula el crecimiento celular independiente de anclaje (Seipel et al., 1999). Por el contrario, el segundo dominio Rho-GEF (TrioGEFD2) actúa específicamente sobre RhoA (Debant et al., 1996), indicando que Trio es una proteína multifuncional que puede enlazar varias rutas de Rho-GTPasa in vivo (Bellanger et al., 1998). Además, TrioGEFD1 se une a las proteínas de unión a la actina llamadas filamina y Tara, proporcionando un enlace directo entre Trio y el citoesqueleto de actina (Bellanger et al., 2000; Seipel et al., 2001).

La comprensión de la función de Trio ha avanzado significativamente a partir de datos recientes obtenidos de diferentes estudios de los miembros de la familia de Trio. Las proteínas Trio de C. elegans y de Drosophila participan en la orientación de los axones y en la migración celular (Steven et al., 1998; Bateman et al., 2000; Liebl et al., 2000; Newsome et al., 2000; Awasaki et al., 2000). TrioGEFD1 aparentemente desempeña un papel importante en dicho proceso, mientras que se desconoce cuál es la función de TrioGEFD2 en el contexto de la proteína de longitud completa. Consistentemente, la proteína de rata similar a Trio llamada kalirina también participa en la función neuronal (Penzes et al., 2001). Finalmente, se ha informado de que la desactivación del gen trio en el ratón resulta letal, y que los embriones trio^- muestran defectos de la organización neuronal y del desarrollo muscular (O'Brien et al., 2000).

La gran familia de Dbl participa en numerosos procesos fisiológicos, y todavía no se dispone de inhibidores específicos. Los Rho-GEF, tales como Trio, muestran múltiples dominios catalíticos, cuya contribución relativa a la función de la proteína no se conoce por completo. Los inhibidores específicos de un dominio catalítico determinado representarían, de esta manera, potentes herramientas para estudios precisos de estructura-función y podrían utilizarse como inhibidores negativos dominantes.

Schmidt et al. (Biology of the Cell vol.92, nº 2, página 172, 2000) mencionan un polipéptido (Apt 38), sin dar a conocer su estructura, que inhibe específicamente TrioGEFD2 in vitro. Este inhibidor ha sido aislado utilizando una biblioteca de aptámeros para determinar los péptidos inhibidores que reconocen específicamente uno u otro dominio GEF de Trio.

El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar inhibidores específicos in vivo de un elemento de la familia de Rho-GEF.

Otro objetivo de la invención consiste en proporcionar nuevos péptidos que inhiban una proteína de la familia de Rho-GEF, particularmente la proteína Trio.

Otro objetivo de la invención consiste en proporcionar inhibidores específicos in vivo de un miembro de la familia de Rho-GEF, que bloqueen específicamente la ruta de RhoA.

Otro objetivo de la invención consiste en proporcionar inhibidores específicos del dominio GEFD2 de Trio.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar inhibidores de TrioGEF2, con el fin de desarrollar fármacos destinados a la protección de los axones frente a la retracción.

La presente invención se refiere a la utilización de una biblioteca de aptámeros para determinar los inhibidores de cualquiera de las proteínas de la familia de Rho-GEF, mediante un procedimiento de cribado apropiado, siendo dicha biblioteca de aptámeros tal como la definida en Geyer et al., 2000.

La gran familia de proteínas Rho-GEF se encuentra implicada en numerosos procesos fisiológicos, pero todavía no se dispone de inhibidores específicos. Los estudios cristalográficos de los Rho-GEF acomplejados con sus dianas GTPasa indican la existencia de numerosos sitios de interacción entre GEF y GTPasa, provocando que la predicción de un inhibidor que sea eficiente resulte imposible. Esto provoca que la utilización de la biblioteca de aptámeros que contiene un gran número de péptidos, las secuencias de los cuales no han sido determinadas, no resulte evidente.

La biblioteca de aptámeros utilizada en la presente invención es una biblioteca descrita en Colas et al., 1996, o en Geyer et al., 2000.

Está constituida de péptidos aleatorios insertados en la tiorredoxina.

La estrategia de la biblioteca de aptámeros desarrollada por P. Colas et al., (1996), se basa en el hecho de que los bucles peptídicos anclados en los extremos tanto amino como carboxi pueden presentar un reconocimiento molecular específico y de alta afinidad. La biblioteca construida dirige la síntesis en levaduras de péptidos de 20 residuos de secuencia aleatoria insertados en el sitio activo (residuo 35) de la tiorredoxina A de E. coli y fusionados con un conjunto modificado de fracciones de proteína del sistema de dos híbridos original de la levadura (Colas et al., 1996; patente WO 96/02561, de Brent et al.). La biblioteca contiene 2,9x10⁹ elementos de dichos péptidos aleatorios restringidos y puede obtenerse tal como se describe en la solicitud de patente internacional WO 96/02561.

Las proteínas de la familia de Rho-GEF pueden seleccionarse de entre los elementos de la familia de Dbl, que invariablemente contienen un dominio DH (dominio de homología de Dbl, en referencia al primer Rho-GEF identificado) que contiene la actividad catalítica, y un dominio PH, que se cree que se encuentra implicado principalmente en el reconocimiento subcelular. Se han identificado más de 40 Rho-GEF en mamíferos.

Un procedimiento apropiado de cribado comprende las etapas siguientes:

1. Polipéptido, caracterizado porque:

2. Fragmento de TRIPa según la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona de entre las secuencias siguientes: SEC ID nº 6, SEC ID nº 8, SEC ID nº 10, SEC ID nº 12, SEC ID nº 14, SEC ID nº 16 y SEC ID nº 18.

3. Variante de TRIAPa según la reivindicación 1, caracterizada porque se selecciona de entre las secuencias siguientes: SEC ID nº 20, SEC ID nº 22, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26, SEC ID nº 28, SEC ID nº 30, SEC ID nº 32, SEC ID nº 34, SEC ID nº 36, SEC ID nº 38, SEC ID nº 40, SEC ID nº 42, SEC ID nº 44, SEC ID nº 46, SEC ID nº 48, SEC ID nº 50, SEC ID nº 52, SEC ID nº 54, SEC ID nº 56, SEC ID nº 58 y SEC ID nº 60.

4. Secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 4, caracterizada porque comprende o está constituida por:

6. Vector recombinante, especialmente un plásmido, un cósmido, un fago o un virus ADN, que contiene una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 5.

7. Vector recombinante según la reivindicación 6, que contiene los elementos necesarios para la expresión en una célula huésped de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos según la reivindicación 5, insertados en dicho vector.

8. Célula huésped aislada, en particular seleccionada de entre bacterias, virus, levaduras, hongos, células vegetales o de mamífero, siendo transformada dicha célula huésped mediante un vector según la reivindicación 6 ó 7, de manera que su genoma contenga una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 5.

9. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Composición farmacéutica según la reivindicación 9, caracterizada porque contiene de aproximadamente 700 µg a aproximadamente 80 mg, preferentemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 40 mg, como una dosis unitaria, del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

11. Utilización de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de un fármaco destinado al tratamiento de patologías relacionadas con el sistema nervioso periférico o con el sistema nervioso central, en particular para el tratamiento de la parálisis accidental relacionada con la médula espinal.