Inhibidores de la caseína cinasa 1 delta (CK1delta).

Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (IB) o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo:

en donde

"Het B" representa indolilo o indolizinilo;

Z representa CO;

R1b representa arilo, cicloalquilo C3-8, heterociclilo monocíclico o bicíclico o un sistema de anillos de heteroarilo monocíclico o bicíclico, en donde R1b puede estar sustituido por uno o varios

(p. ej., 1, 2 o 3) grupos R4b;

R4b representa grupos halógeno, alquilo C1-6, alquenilo C1-6, alquinilo C1-6, cicloalquilo C3-8, haloalquilo C1-6, hidroxilo, alcoxi C1-6, -O-alquenilo C1-6, haloalcoxi C1-6, -COOH, -CO-alquilo C1-6, -COO-alquilo C1-6, -CONH2, -CH2-CONH2, -NH-alquilo C1-6, -NH-alquenilo C2-6, -NH-CO-alquilo C1-6, -CO-NH-alquilo C1-6, -O-CH2-CO-NH-alquilo C1-6, -CH2- CH2-CO-NH-alquilo C1-6, -S-alquilo C1-6, -SO-alquilo C1-6, -SO2-alquilo C1-6, -SO2-NH2, -SO2-NH-alquilo C1-6, -S-CH2- CO-alquenilo C2-6, -SO2-OH, amino, ciano, NO2, ≥O, -CO-NH-(CH2)2)-OMe, -NH-cicloalquilo C3-8, -CH2-CO-NH cicloalquilo C3-8, -CO-heterociclilo, -CO-heteroarilo, -COO-(CH2)2-heterociclilo, -CH2-arilo, -OCH2-arilo, -OCH2- heteroarilo, -CH2-O-CO-arilo, -O-arilo, -NH-CO-arilo, -NH-CO-heteroarilo, -NH-CO-CH2-arilo, -NH-arilo, arilo o heteroarilo, en donde dichos grupos arilo, heterociclilo o heteroarilo de R4b pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos halógeno, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, ≥S o hidroxilo y en donde dichos grupos alquilo C1-6 o alquenilo C2-6 de R4b pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos hidroxilo, amino, ciano, alcoxi C1-6, CONH2 o -COO-alquilo C1-6;

m representa 2; y

R2b representa amino o -CONH2.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2011/052473.

Solicitante: ELECTROPHORETICS LIMITED.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: COVEHAM HOUSE DOWNSIDE BRIDGE ROAD COBHAM SURREY KT11 3EP REINO UNIDO.

Inventor/es: PIKE,IAN, SHERIDAN,JOSEPH M, HEAL,JONATHAN R, HAMILTON,WILLIAM D.O.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K31/00 (Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen ingredientes... > A61K31/506 (no condensadas y conteniendo otros heterociclos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen ingredientes... > A61K31/4439 (conteniendo un ciclo de cinco eslabones con el nitrógeno como heteroátomo del ciclo, p. ej. omeprazol (nicotina A61K 31/465))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen ingredientes... > A61K31/437 (conteniendo el sistema heterocíclico un ciclo de cinco eslabones teniendo el nitrógeno como heteroátomo del ciclo, p. ej. indolicina, beta-carbolina)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > Medicamentos para el tratamiento de trastornos del... > A61P25/28 (de los problemas neurodegenerativos del sistema nervioso central, p. ej. noótropos, activadores del conocimiento, medicamentos para el tratamiento del Alzheimer o de otras formas de demencia)
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Ilustración 1 de Inhibidores de la caseína cinasa 1 delta (CK1delta).
Ilustración 2 de Inhibidores de la caseína cinasa 1 delta (CK1delta).
Ilustración 3 de Inhibidores de la caseína cinasa 1 delta (CK1delta).
Ilustración 4 de Inhibidores de la caseína cinasa 1 delta (CK1delta).
Ilustración 5 de Inhibidores de la caseína cinasa 1 delta (CK1delta).
Inhibidores de la caseína cinasa 1 delta (CK1delta).

Texto extraído del PDF original:

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de la caseína cinasa 1delta (CK1δ) La invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden inhibidores de la caseína cinasa 1 delta (CK1δ) y al uso de dichos inhibidores en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer.

La enfermedad de Alzheimer (EA; también conocida como demencia senil de tipo Alzheimer (DSTA), demencia degenerativa primaria de tipo Alzheimer (DTA) o Alzheimer) es la forma más común de demencia. Muy frecuentemente, la enfermedad de Alzheimer se diagnostica en personas mayores de 65 años de edad, aunque el Alzheimer de inicio temprano, menos frecuente, puede producirse mucho antes. En el año 2006, había 26,6 millones de enfermos en todo el mundo. Se prevé que el Alzheimer afectará a 1 de cada 85 personas globalmente en el año 2050.

La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la presencia de placas seniles y ovillos neurofibrilares en el cerebro. El grado de demencia al morir se correlaciona mejor con el número de ovillos neurofibrilares que con el recuento de placas seniles. La presencia de ovillos neurofibrilares en las neuronas produce como resultado la muerte de esas neuronas, lo que implica que una prevención de la formación de ovillos es un objetivo terapéutico importante. La principal proteína que forma el ovillo neurofibrilar es la proteína asociada a microtúbulos, tau, la cual se ensambla en filamentos que tienen la apariencia de girar uno sobre otro en parejas y se conocen como filamentos helicoidales emparejados (FHA). Los FHA están presentes en diferentes lugares en neuronas degeneradas en el cerebro de Alzheimer y cuando se agregan muchos en el cuerpo celular neuronal, producen el ovillo neurofibrilar (Lee et al, 2001).

Los depósitos intraneuronales de tau en forma de ovillos neurofibrilares típicos de la EA u otros agregados de tau morfológicamente distintos, en una variedad de otras enfermedades neurodegenerativas, son la base para agrupar estas afecciones como tauopatías. Por lo tanto, además de la EA, los principales ejemplos de tauopatías son la demencia frontotemporal con parkinsonismo, ligada al cromosoma 17 (FTDP-17), la parálisis supranuclear progresiva (PSP), la enfermedad de Pick, la degeneración corticobasal y la atrofia multisistémica (MSA). Los depósitos intracelulares de tau (usualmente neuronales pero también pueden ser gliales) son todos filamentosos y en su mayoría en un estado hiperfosforilado, en comparación con el nivel de fosforilación de tau de un cerebro humano de control. En el caso de la EA, esta tau hiperfosforilada se conoce frecuentemente como FHA-tau, ya que se obtiene a partir de los FHA.

Tau es una fosfoproteína en la que la función de fosforilación todavía no se ha establecido de forma inequívoca. Sin embargo, un aumento de la fosforilación de tau en múltiples residuos de serina y treonina reduce la capacidad de tau para favorecer el ensamblaje de los microtúbulos y estabilizar los microtúbulos ensamblados, efectos que se han demostrado tanto in vitro como en células. Muchos estudios han mostrado que FHA-tau de cerebro con EA se fosforila más fuertemente en serina y treonina que tau de un cerebro control. Esto se ha demostrado en parte mediante la secuenciación de proteínas y en parte mediante la demostración de que ciertos anticuerpos monoclonales solo marcan ya sea FHA-tau o tau no fosforilada y no FHA-tau; en los epítopos de muchos de estos anticuerpos se han cartografiado en particular residuos fosforilados presentes en FHA-tau y ausentes de la tau de un cerebro control. La tau patológica de la mayoría de otros casos de tauopatías, parece estar hiperfosforilada de manera similar a FHA-tau.

Estos resultados implican fuertemente que anomalías similares en la regulación de la fosforilación de tau se comparten en todas los tauopatías, incluyendo EA.

Se ha sugerido que un número de proteínas cinasas dirigidas a prolina y no dirigidas a prolina tienen un papel en la generación de FHA-tau en el cerebro del Alzheimer, incluyendo la caseína cinasa 1. La caseína cinasa 1 de mamífero está presente en forma de múltiples isoformas CK1α, CK1β, CK1y1, CK1y2, CK1y3, CK1δ y CK1ε. El papel de CK1δ como una cinasa de tau potencial es de particular interés ya que se ha informado de que la proteína CK1δ se incrementa más de 30 veces en el hipocampo de un cerebro con Alzheimer, en comparación con controles equivalentes (Ghoshal, N. et al (1999) Am. J. Pathol 155, 1163-1172) mientras que su contenido en ARNm se incrementa 24 veces (Yasojima, K. et al (2000) Brain Res 865, 116-120) y se ha observado que CK1 también está fuertemente asociada con FHA (Kuret, J.et al (1997) J. Neurochem 69, 2506-2515). También se ha informado de que CK1δ fosforila tau en dos epítopos detectados usando anticuerpos monoclonales fosfoespecíficos para tau, y la expresión exógena de CK1δ en células no neuronales reduce la unión de tau a los microtúbulos (Li, G. et al (2004) J. Biol. Chem. 279, 15938-15945). Es de destacar en el contexto de la enfermedad de Alzheimer, un informe de que la actividad de CK1 está estimulada por péptido beta-amiloide (Αβ), un componente de las placas neuríticas seniles que, junto con los ovillos, caracterizan un cerebro de Alzheimer (Chauhan, A. et al (1993) Brain Res. 629, 47-52).

Una evidencia adicional de una posible participación de CK1 en la enfermedad de Alzheimer, proviene de la influencia mencionada de CK1 en la regulación de la producción de Αβ en las neuronas (Flajolet, M. et al (2007) PNAS USA 104, 4159-4164). Un trabajo adicional ha confirmado que al menos 6 sitios de fosforilación identificados recientemente en FHA-tau (todos en residuos de serina o treonina) pueden ser generados por CK1δ. El hallazgo de una variedad de sitios de fosforilación en FHA-tau para los que CK1 es una cinasa candidata importante, incluyendo tres para los que es la única cinasa conocida, implica que CK1 puede tener una contribución importante en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer (Hanger et al (2007) J. Biol. Chem. 282, 23645-23654).

El documento US 2010/152157 describe derivados de 6-cicloamino-3-(piridazin-4-il)imidazo[1,2-b]piridazina y métodos preparativos y usos terapéuticos de los mismos. El documento US 2010/179154 describe derivados de 6- cicloamino-3-(piridin-4-il)imidazo[1,2-b]piridazina y métodos preparativos y usos terapéuticos de los mismos. El documento WO 2010/130934 describe derivados de 2-cicloamino-5-(piridin-4-il)imidazo[2,1-b][1,3,4]tiadiazol y métodos preparativos y usos terapéuticos de los mismos.

Por tanto, existe una necesidad de inhibidores de CK1δ que pueden tener un beneficio terapéutico potencial en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, tales como tauopatías que incluyen la enfermedad de Alzheimer, la demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17 (FTDP-17), la parálisis supranuclear progresiva (PSP), la enfermedad de Pick, la degeneración corticobasal y la atrofia multisistémica (MSA).

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (IB) o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de la misma: en la que "Het B" representa indolilo o indolizinilo; Z representa CO; R1b representa arilo, cicloalquilo C3-8, heterociclilo monocíclico o bicíclico o un sistema de anillo heteroarilo monocíclico o bicíclico, en el que R1b puede estar sustituido por uno o varios (p. ej., 1, 2 o 3) grupos R4b; R4b representa grupos halógeno, alquilo C1-6, alquenilo C1-6, alquinilo C1-6, cicloalquilo C3-8, haloalquilo C1-6, hidroxilo, alcoxi C1-6, -O-alquenilo C1-6, haloalcoxi C1-6, -COOH, -CO-alquilo C1-6, -COO-alquilo C1-6, -CONH2, -CH2-CONH2, - NH-alquilo C1-6, -NH-alquenilo C2-6, -NH-CO-alquilo C1-6, -CO-NH-alquilo C1-6, -O-CH2-CO-NH-alquilo C1-6, -CH2-CH2- CO-NH-alquilo C1-6, -S-alquilo C1-6, -SO-alquilo C1-6, -SO2-alquilo C1-6, -SO2-NH2, -SO2-NH-alquilo C1-6, -S-CH2-CO- alquenilo C2-6, -SO2-OH, amino, ciano, NO2, =O, -CO-NH-(CH2)2)-OMe, -NH-cicloalquilo C3-8, -CH2-CO-NH- cicloalquilo C3-8, -CO-heterociclilo, -CO-heteroarilo, -COO-(CH2)2-heterociclilo, -CH2-arilo, -OCH2-arilo, -OCH2- heteroarilo, -CH2-O-CO-arilo, -O-arilo, -NH-CO-arilo, -NH-CO-heteroarilo, -NH-CO-CH2-arilo, -NH-arilo, arilo o heteroarilo, en donde dichos grupos arilo, heterociclilo o heteroarilo de R4b pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos halógeno, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, =S o hidroxilo y en donde dichos grupos alquilo C1-6 o alquenilo C2-6 de R4b pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos hidroxilo, amino, ciano, alcoxi C1-6, CONH2 o -COO-alquilo C1-6; m representa 2; R2b representa amino o -CONH2.

Según un aspecto particular de la invención que se puede mencionar, se proporciona un compuesto de fórmula (IB) o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de la misma: en la que "Het B" representa indolilo o indolizinilo; Z representa CO; R1b representa arilo, cicloalquilo C3-8, heterociclilo monocíclico o bicíclico o un sistema de anillo heteroarilo monocíclico o bicíclico, en el que R1b puede estar sustituido por uno o varios (p. ej., 1, 2 o 3) grupos R4b; R4b representa grupos halógeno, alquilo C1-6, alquenilo C1-6, alquinilo C1-6, cicloalquilo C3-8, haloalquilo C1-6, hidroxilo, alcoxi C1-6, -O-alquenilo C1-6, haloalcoxi C1-6, -COOH, -CO-alquilo C1-6, -COO-alquilo C1-6, -CONH2, -CH2-CONH2, - NH-alquilo C1-6, -NH-alquenilo C2-6, -NH-CO-alquilo C1-6, -CO-NH-alquilo C1-6, -O-CH2-CO-NH-alquilo C1-6, -CH2-CH2- CO-NH-alquilo C1-6, -S-alquilo C1-6, -SO-alquilo C1-6, -SO2-alquilo C1-6, -SO2-NH-alquilo C1-6, -S-CH2-CO-alquenilo C2- 6, -SO2-OH, amino, ciano, NO2, =O, -CO-NH-(CH2)2)-OMe, -NH-cicloalquilo C3-8, -CH2-CO-NH-cicloalquilo C3-8, -CO- heterociclilo, -CO-heteroarilo, -COO-(CH2)2-heterociclilo, -OCH2-arilo, -OCH2-heteroarilo, -CH2-O-CO-arilo, -O-arilo, - NH-CO-arilo, -NH-CO-heteroarilo, -NH-CO-CH2-arilo, -NH-arilo, arilo o heteroarilo, en donde dichos grupos arilo, heterociclilo o heteroarilo de R4b pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos halógeno, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, =S o hidroxilo y en donde dichos grupos alquilo C1-6 o alquenilo C2-6 de R4b pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o varios grupos hidroxilo, amino, ciano, alcoxi C1-6, CONH2 o -COO-alquilo C1-6; m representa 2; R2b representa amino o -CONH2; para uso como un inhibidor de la caseína cinasa 1 delta (CK1δ) en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo, como las tauopatías.

En una realización del compuesto de fórmula (IB) "Het B" representa indolilo o indolizinilo; Z representa CO; R1b representa un sistema de anillo arilo o heteroarilo monocíclico, en donde R1b se puede sustituir por uno o varios (p. ej., 1, 2 o 3) grupos R4b; R4b representa grupos halógeno, hidroxilo, -O-alquenilo C1-6, -COO-alquilo C1-6, -NH-alquilo C1-6, -SO2-NH2, amino, ciano, =O, -CH2-CO-NH-cicloalquilo C3-8, -CH2-arilo, -OCH2-heteroarilo, -O-arilo, -NH-CO-arilo, -NH-arilo o heteroarilo, en donde dichos grupos arilo, heterociclilo o heteroarilo de R4b pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos halógeno, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, =S o hidroxilo y en donde dichos grupos alquilo C1-6 o alquenilo C2-6 de R4b pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o varios grupos hidroxilo, amino, ciano, alcoxi C1-6, CONH2 o -COO-alquilo C1-6; m representa 2; y R2b representa amino o -CONH2.

En una realización, R1b representa un sistema de anillo arilo o heteroarilo monocíclico, en el que R1b puede estar sustituido por uno o varios (p. ej., 1, 2 o 3) grupos R4b. En una realización adicional, R1b representa un grupo arilo monocíclico tal como fenilo sustituido opcionalmente por uno o varios (p. ej., 1) grupos R4b. En una realización alternativa, R1b representa un grupo heteroarilo monocíclico tal como tienilo, pirimidinilo o pirazolinilo sustituido opcionalmente por uno o varios (p. ej., 1 o 2) grupos R4b.

En una realización, R4b representa grupos halógeno, hidroxilo, -O-alquenilo C1-6, -COO-alquilo C1-6, -NH-alquilo C1-6, -SO2-NH2, amino, ciano, =O, -CH2-CO-NH-cicloalquilo C3-8, -CH2-arilo, -OCH2-heteroarilo, -O-arilo, -NH-CO-arilo, - NH-arilo o heteroarilo, en donde dichos grupos arilo, heterociclilo o heteroarilo de R4b pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos halógeno, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, =S o hidroxilo y en donde dichos grupos alquilo C1-6 o alquenilo C2-6 de R4b pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o varios grupos hidroxilo, amino, ciano, alcoxi C1-6, CONH2 o -COO-alquilo C1-6.

En una realización adicional, R4b representa halógeno (p. ej., flúor), amino o heteroarilo (p. ej., piridilo).

En una realización, el compuesto de fórmula (IB) se selecciona a partir de cualquiera de los compuestos 847, 987, 990 o 999 como se describen en esta memoria o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de los mismos.

En todavía otra realización, el compuesto de fórmula (IB) es el compuesto 847 como se describe en esta memoria o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo.

En una realización, el compuesto de fórmula (IB) se selecciona a partir de cualquiera de los compuestos 847, 987, 990 o 999 como se describen en esta memoria o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de los mismos.

Los compuestos de esta realización se sometieron al ensayo de inhibición de CK1δ como se describe en esta memoria y mostraron una inhibición superior al 5%.

En una realización adicional, el compuesto de fórmula (IB) se selecciona a partir de cualquiera de los compuestos 847, 987, 990 o 999 como se describen en esta memoria o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de los mismos. Los compuestos de esta realización se sometieron al ensayo de inhibición de CK1δ como se describe en esta memoria y mostraron una inhibición superior al 50%.

En otra realización adicional, se selecciona el compuesto de fórmula (IB) a partir de uno cualquiera de los compuestos: 2-amino-3-[(tiofen-2-il)carbonil]indolizin-1-carboxamida (Compuesto 847); 2-amino-3-[(4-fluorofenil)carbonil]indolizin-1-carboxamida (Compuesto 987); 2-amino-3-benzoilindolizin-1-carboxamida (Compuesto 990); y 2-amino-1-[(4-fluorofenil)carbonil]-1H-indol-3-carboxamida (Compuesto 999); o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos.

En aún otra realización, el compuesto de fórmula (IB) se selecciona a partir de cualquiera de los compuestos 987, 990 o 999 como se describen en esta memoria o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de los mismos. Los compuestos de esta realización se sometieron al ensayo de inhibición de CK1δ como se describe en esta memoria y mostraron una inhibición superior al 90%.

En aún una realización adicional, el compuesto de fórmula (IB) se selecciona a partir de cualquiera de los compuestos 987 y 999 como se describe en esta memoria o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de los mismos. Los compuestos de esta realización se sometieron a una serie de ensayos de inhibición de cinasa y no solo mostraron una inhibición mayor del 90% en el ensayo de inhibición de CK1δ como se describe en esta memoria, sino que también mostraron una inhibición significativa y selectiva de CK1δ cuando se comparó con otras cinasas.

Por ejemplo, el compuesto comparativo número 324 (5-(1,3-benzoxazol-2-il)-4-(piridin-4-il)pirimidin-2-amino) mostraba selectividad hacia CK1δ sobre ABL2/ARG, ALK4/ACVR1B, ALK5/TGFBR1, CDK5/p25, CK1a1, CK1g1, CK1g3, CLK2, c-SRC, EGFR, EPHA2, FGFR1, GSK3b, HGK/MAP4K4, JNK2, KDR/VEGFR2, LCK, MSK1/RPS6KA5, PDK1/PDPK1, PIM3, PKA, PKCa, PKCb2, RIPK2, ROCK1, TNIK y YES/YES1, cada uno de los cuales se inhibió a niveles inferiores al 40%.

Por ejemplo, el compuesto comparativo número 952 (2-[3-(piridin-4-il)-1H-pirazol-4-il]-1,3-benzoxazol) mostraba selectividad hacia CK1δ sobre ABL2/ARG, ALK4/ACVR1B, ALK5/TGFBR1, CDK5/p25, CK1g1, CK1g2, CK1g3, c- SRC, EGFR, EPHA2, FGFR1, KDR/VEGFR2, LCK, MSK1/RPS6KA5, PDK1/PDPK1, PIM3, PKA, PKCa, PKCb2, ROCK1 y YES/YES1, cada uno de los cuales se inhibió a niveles inferiores al 40%.

Por ejemplo, el compuesto número 987 (2-amino-3-[(4-fluorofenil)carbonil]indolizin-1-carboxamida) mostraba selectividad hacia CK1δ sobre ABL2/ARG, CDK5/p25, CK1g1, CK1g2, CK1g3, CLK2, c-SRC, FGFR1, GSK3b, HGK/MAP4K4, JNK2, KDR/VEGFR2, LCK, MSK1/RPS6KA5, PDK1/PDPK1, PIM3, PKCa, PKCb2, ROCK1 y TNIK, cada uno de los cuales se inhibió a niveles inferiores al 40%.

Por ejemplo, el compuesto número 999 (2-amino-1-[(4-fluorofenil)carbonil]-1H-indol-3-carboxamida) mostraba selectividad hacia CK1δ sobre ABL2/ARG, CDK5/p25, CK1g1, CK1g2, CLK2, c-SRC, FGFR1, GSK3b, HGK/MAP4K4, KDR/VEGFR2, LCK, MSK1/RPS6KA5, PDK1/PDPK1, PIM3, PKCa, PKCb2 y ROCK1, cada uno de los cuales se inhibió a niveles inferiores al 40%.

En todavía otra realización, el compuesto de fórmula (IB) es el compuesto 987 como se describe en esta memoria o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo. El compuesto de esta realización ha demostrado tener un efecto protector sobre la viabilidad celular como se puede observar en los datos presentados en este documento y en particular en las Figuras 1 y 2. El compuesto de esta realización también ha mostrado que inhibe la fosforilación de dos residuos de aminoácidos diferentes dentro de las proteínas Tau (es decir, Ser 396 y Thr 391) como se muestra en las Figuras 4 y 5.

En el presente contexto, la expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se entiende que indica sales que no sean perjudiciales para el paciente. Tales sales incluyen sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables, sales de metales farmacéuticamente aceptables y sales de adición alcalinas farmacéuticamente aceptables. Las sales de adición de ácido incluyen sales de ácidos inorgánicos así como de ácidos orgánicos.

Ejemplos representativos de ácidos inorgánicos adecuados incluyen ácido clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, fosfórico, sulfúrico, nítrico y similares. Ejemplos representativos de ácidos orgánicos adecuados incluyen ácido fórmico, acético, tricloroacético, trifluoroacético, propiónico, benzoico, cinámico, cítrico, fumárico, glicólico, láctico, maleico, málico, malónico, mandélico, oxálico, pícrico, pirúvico, salicílico, succínico, metanosulfónico, etanosulfónico, tartárico, ascórbico, pamoico, bismetilen salicílico, etanodisulfónico, glucónico, citracónico, aspártico, esteárico, palmítico, EDTA, glicólico, p-aminobenzoico, glutámico, benzosulfónico p-toluenosulfónico y similares. Otros ejemplos de sales de adición de ácido inorgánico u orgánico, farmacéuticamente aceptables incluyen las sales farmacéuticamente aceptables mencionadas en J. Pharm. Sci. 1977, 66, 2. Ejemplos de sales metálicas incluyen sales de litio, sodio, potasio, magnesio y similares. Ejemplos de sales de amonio y de amonio alquilado incluyen sales de amonio, metilamonio, dimetilamonio, trimetilamonio, etilamonio, hidroxietilamonio, dietilamonio, butilamonio, tetrametilamonio y similares.

Ejemplos representativos de sales alcalinas incluyen, por ejemplo, sodio, potasio, litio, calcio, magnesio o amonio, o bases orgánicas tales como, por ejemplo, metilamina, etilamina, propilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, N,N-dimetiletanolamina, tris(hidroximetil)aminometano, etanolamina, piridina, piperidina, piperazina, picolina, diciclohexilamina, morfolina, bencilamina, procaína, lisina, arginina, histidina, N-metilglucamina.

De acuerdo con la invención, los compuestos de fórmula (IB) pueden estar en forma racémica, así como en forma de enantiómeros puros o una mezcla de enantiómeros no racémicos (escalémica), que incluye cuando los compuestos de fórmula (IB) tienen más de un centro estereogénico. En el caso de que los compuestos de fórmula (IB) tengan dobles enlaces carbono-carbono insaturados, tanto los isómeros cis (Z) como trans (E) y sus mezclas pertenecen a la invención.

Las referencias a "halógeno" en esta memoria significan un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo.

Las referencias en esta memoria a "alquilo C1-6" significan cualquier grupo hidrocarbonado lineal, ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, o grupos de hidrocarburos cíclicos que tienen de 3 a 6 átomos de carbono. Ejemplos representativos de tales grupos alquilo incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo y t- butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. Las referencias a "haloalquilo C1-6" significan un grupo alquilo C1-6 sustituido con uno o varios átomos de halógeno como se define en esta memoria.

Las referencias en esta memoria a "alquileno C1-6" se refieren a una cadena de hidrocarburo divalente saturado que tiene el número especificado de átomos de carbono. Por ejemplo, alquileno C1-6 se refiere a un enlace o a un grupo alquileno que tiene de 1 a 6 átomos miembros. Los grupos alquileno pueden ser lineales o ramificados. Grupos alquileno ramificados representativos tienen una o dos ramificaciones. Alquileno incluye metileno, etileno, propileno (n-propileno e isopropileno) y butileno (n-butileno, isobutileno y t-butileno).

Las referencias en esta memoria a "alquenilo C2-6" significan cualquier grupo de hidrocarburo lineal, ramificado de 2 a 6 átomos de carbono, o un grupo de hidrocarburo cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono que tiene al menos un doble enlace. Ejemplos representativos de tales grupos alquenilo incluyen etenilo, propenilo, butenilo y ciclohexenilo.

Las referencias en esta memoria a "alquinilo C2-6" significan cualquier grupo de hidrocarburo lineal o ramificado de 2 a 6 átomos de carbono que tiene al menos un triple enlace. Ejemplos representativos de tales grupos alquinilo incluyen etinilo, propargilo y butinilo.

Las referencias en esta memoria a 'alcoxi C1-6' significan un grupo -O-alquilo C1-6 en donde el alquilo C1-6 es como se ha definido en esta memoria. Ejemplos de tales grupos incluyen metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, pentoxi o hexoxi y similares.

Las referencias en esta memoria a 'cicloalquilo C3-8' significan un anillo de hidrocarburo monocíclico saturado de 3 a 8 átomos de carbono. Ejemplos de tales grupos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo o ciclooctilo y similares.

Las referencias en esta memoria a 'arilo' significan un anillo de hidrocarburo monocíclico o bicíclico C6-12 en el que al menos un anillo es aromático. Ejemplos de tales grupos incluyen fenilo, indilo o naftilo y similares.

Las referencias en esta memoria a "heteroátomo" significan un átomo de nitrógeno, azufre o de oxígeno.

Las referencias en esta memoria a "heterociclilo" significan un anillo no aromático saturado o insaturado que contiene de 1 a 4 heteroátomos como átomos miembros en el anillo. Los grupos heterociclilo que contienen más de un heteroátomo pueden contener heteroátomos diferentes. Los grupos heterociclilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o varios sustituyentes como se define en esta memoria. Los grupos heterociclilo son sistemas de anillos monocíclicos o sistemas de anillos bicíclicos o policíclicos fusionados o estructuras bicíclicas conocidas como sistemas de anillos heterocíclicos "espiro". En ciertas realizaciones, el heterociclilo está saturado. En otras realizaciones, el heterociclilo está insaturado y no es aromático. Ejemplos no limitantes de sistemas de anillos heterociclilos monocíclicos incluyen pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, piranilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, tetrahidrotienilo, pirazolidinilo, oxazolidinilo, tiazolidinilo, piperidinilo, homopiperidinilo, piperazinilo, morfolinilo, tiamorfolinilo, 1,3-dioxolanilo, 1,3-dioxanilo, 1,4-dioxanilo, 1,3- oxatiolanilo, 1,3-oxatianilo, 1,3-ditianilo y azetidinilo.

Las referencias en esta memoria a "heteroarilo" significan un anillo aromático que contiene de 1 a 4 heteroátomos como átomos miembros en el anillo. Los grupos heteroarilo que contienen más de un heteroátomo, pueden contener heteroátomos diferentes. Los grupos heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o varios sustituyentes como se define en esta memoria. Los grupos heteroarilo son sistemas de anillos monocíclicos o son sistemas de anillos bicíclicos o policíclicos fusionados. Los anillos de heteroarilo monocíclicos tienen 5 o 6 átomos miembros. Los anillos de heteroarilo bicíclicos tienen de 7 a 11 átomos miembros. Los anillos de heteroarilo bicíclicos incluyen aquellos anillos en los que un fenilo y un anillo de heterociclilo monocíclico están unidos formando un sistema de anillos bicíclicos condensados, y aquellos anillos en los que un anillo heteroarilo monocíclico y un anillo cicloalquilo, cicloalquenilo, heterociclilo o heteroarilo monocíclico están unidos formando un sistema de anillos bicíclicos fusionados. Ejemplos no limitantes de heteroarilo incluyen pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, furanilo, furazanilo, tienilo, triazolilo, piridinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo, triazinilo, tetrazinilo, indolilo, isoindolilo, indolizinilo, indazolilo, purinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, pteridinilo, cinolinilo, bencimidazolilo, benzopiranilo, benzoxazolilo, benzofuranilo, isobenzofuranilo, benzotiazolilo, benzotienilo, furopiridinilo y naftiridinilo.

Las referencias en esta memoria a "sistema de anillos heterocíclicos" significan un sistema de anillos heterociclilos o un sistema de anillos heteroarilos como se han definido anteriormente.

Compuestos representativos de fórmula (IB) incluyen los compuestos tal y como se describen a continuación:

Número de Compuesto

Estructura

847 987 990 999 Compuestos comparativos de fórmula (IB) incluyen los compuestos tal y como se describen a continuación:

Número de compuesto

Estructura

2 3 26 27 28 31 32

Número de compuesto

Estructura

33 47 48 51 54 57

Número de compuesto

Estructura

58 59 63 64 78

Número de compuesto

Estructura

84 113 123 127 128 129

Número de compuesto

Estructura

145 155 156 157 171 172

Número de compuesto

Estructura

173 204 206 207 210 225

Número de compuesto

Estructura

227 233 235 236 241 242

Número de compuesto

Estructura

244 249 269 285 288 303

Número de compuesto

Estructura

307 308 309 310 311 312 314

Número de compuesto

Estructura

315 316 320 324 325 333 336

Número de compuesto

Estructura

351 357 358 359 360 373

Número de compuesto

Estructura

374 375 384 385 386 387

Número de compuesto

Estructura

388 389 390 391 396 399 400

Número de compuesto

Estructura

401 402 404 405 407 408 409 410

Número de compuesto

Estructura

411 414 424 425 427 428 437

Número de compuesto

Estructura

448 456 457 458 482 484

Número de compuesto

Estructura

485 489 490 491 495 496 497

Número de compuesto

Estructura

498 505 507 516 519 524

Número de compuesto

Estructura

526 553 559 560 568 570 575

Número de compuesto

Estructura

585 590 594 596 597 601

Número de compuesto

Estructura

602 609 615 616 618 626 627

Número de compuesto

Estructura

638 649 653 669 692 693 694 703

Número de compuesto

Estructura

705 709 712 716 719 725 734

Número de compuesto

Estructura

738 740 746 749 753 754 756

Número de compuesto

Estructura

758 759 767 770 777 778 784 785

Número de compuesto

Estructura

790 792 796 800 801 804 805 808

Número de compuesto

Estructura

819 821 827 828 831 833 838 844

Número de compuesto

Estructura

857 858 869 872 875 877 891 910

Número de compuesto

Estructura

912 926 933 952 955 962 963 969 De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un compuesto de fórmula (IB) para uso como un inhibidor de la caseína cinasa 1 delta (CK1δ) en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo, tal como tauopatías.

Los compuestos de fórmula 2-3, 26-28, 30-33, 35, 47-48, 51, 57-60, 63-64, 78, 84, 113, 123, 127-129, 145, 155-157, 171-173, 204, 206-207, 210, 225, 227, 233, 235-236, 241-242, 244, 249, 269, 285, 288, 303, 307-312, 314-316, 320, 324-325, 333, 336, 351, 357-360, 374-375, 384-391, 396, 399-402, 404-405, 407-411, 414, 424-425, 427-428, 437, 448, 456-457, 482, 484-485, 489-491, 495, 497-498, 505, 507, 516, 519, 524, 526, 553, 559-560, 568, 570, 575, 609, 615-616, 618, 626-627, 638, 653, 669, 692-694, 705, 709, 712, 716, 719, 725, 734, 738, 740, 746, 749, 753- 754, 756, 758-759, 767, 770, 777, 784-785, 790, 792, 796, 800-801, 804-805, 808, 819, 821, 827-828, 831, 833, 838, 844, 847, 857-858, 869, 872, 875, 933, 952, 955, 969, 987, 990 o 999 o bien están disponibles comercialmente o se pueden preparar de acuerdo con procedimientos sintéticos conocidos.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (IB) para uso en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo, tal como tauopatías.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender, además de una de las sustancias anteriores, un excipiente, un vehículo, un tampón, un estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables, bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo o de otro material puede depender de la vía de administración, por ejemplo, las vías oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular, intraperitoneal.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en forma de comprimido, cápsula, polvo o líquido. Un comprimido puede incluir un vehículo sólido tal como gelatina o un adyuvante.

Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen generalmente un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético.

Se puede incluir una solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para una inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o una inyección en el sitio de la enfermedad, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que está exenta de pirógenos y tiene un pH, una isotonicidad y una estabilidad adecuados. Los expertos relevantes en la técnica son muy capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como una inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de Ringer con lactato. Si es necesario, se pueden incluir agentes conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos.

Los compuestos de fórmula (IB) se cree que son inhibidores de la caseína cinasa 1 delta (CK1δ). Ciertos compuestos de fórmula (IB) tienen actividad inhibidora superior al 5%, en particular superior al 10%, más particularmente superior al 25%, aún más particularmente superior al 50%, especialmente superior al 75%, tal como superior al 90%. Tales compuestos pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos tales como tauopatías. Las tauopatías son afecciones que se caracterizan por ovillos neurofibrilares o agregados de la proteína tau. Las tauopatías son una clase reconocida de afecciones conocidas por los expertos en la técnica e incluyen la enfermedad de Alzheimer, la demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17 (FTDP-17), la parálisis supranuclear progresiva (PSP), la enfermedad de Pick, la degeneración corticobasal, la atrofia multisistémica (MSA), la degeneración neurobasal con acumulación de hierro, tipo 1 (Hallervorden-Spatz), la demencia con granos argirófilos, el síndrome de Down, los ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, la demencia pugilística, la enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, la distrofia miotónica, la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, la gliosis subcortical progresiva, la angiopatía amiloide cerebral con proteína priónica, la demencia solo con ovillos, el parkinsonismo postencefalítico, la panencefalitis esclerosante subaguda, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, el complejo esclerosis lateral amiotrófica/demencia con parkinsonismo, la enfermedad de la motoneurona no de Guam con ovillos neurofibrilares/demencia y la enfermedad de Parkinson. Los depósitos intracelulares de tau son usualmente neuronales o gliales y son filamentosos y generalmente están en un estado hiperfosforilado, en comparación con el nivel de fosforilación en la tau de un cerebro humano de control. En el caso de EA, se hace referencia frecuentemente a esta tau hiperfosforilada como a un filamento helicoidal emparejado de tau (FHA) porque se obtiene a partir del FHA. En una realización, la tauopatía comprende la enfermedad de Alzheimer.

Datos Biológicos

1. Ensayo de inhibición de CK1δ

Los compuestos de la invención se pueden someter a ensayos de inhibición de la caseína cinasa 1 delta (CK1δ) de acuerdo con los protocolos de ensayo descritos en el documento US 2010/0152157, EP 1.636.375 o Hanger et al (2007) J. Biol. Chem. 282, 23645-23654. En particular, el ensayo se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo:

Tampón de reacción:

Tampón de reacción base; Hepes 20 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, EGTA 1 mM, 0,02% de Brij35, 0,02 mg/ml de BSA, Na3VO4 0,1 mM, DTT 2 mM, 1% de DMSO Cabe señalar que los cofactores requeridos se añaden individualmente a cada reacción de cinasa.

Procedimiento de reacción:

1. Preparar el sustrato indicado en el Tampón de reacción base recién preparado como se ha descrito anteriormente 2. Añadir los cofactores necesarios a la solución de sustrato 3. Añadir la cinasa indicada a la solución de sustrato y mezclar suavemente 4. Añadir los compuestos en DMSO a la mezcla de reacción de la cinasa 5. Añadir 33P-ATP (actividad específica 0,01 µCi/µl final) a la mezcla de reacción para iniciar la reacción 6. Incubar la reacción de la cinasa durante 120 min a temperatura ambiente 7. Las reacciones se detectaron sobre papel de intercambio iónico P81 (Whatman nº 3698-915) 8. Lavar a fondo los filtros en ácido fosfórico al 0,75%

Información de la cinasa:

CK1d - nº de orden de Genbank NP_620693 Estructura artificial recombinante humana de longitud completa. Marcada con GST, expresada en células de insecto.

Concentración final en el ensayo = 4 nM Sustrato: CK1tide Secuencia del sustrato: [KRRRAL[pS]VASLPGL] Concentración final del sustrato en el ensayo = 20 µM Cabe señalar que no se añaden cofactores adicionales a la mezcla de reacción.

Los compuestos 30, 288, 314, 324-325, 336, 374, 391, 405, 615-616, 626, 705, 740, 753-754, 756, 759, 770, 784, 808, 819, 833, 844, 847, 869, 872, 875, 933, 952, 955, 969, 987, 990 y 999 se sometieron al ensayo de inhibición de CK1δ y mostraron una inhibición superior al 5%.

En particular, los compuestos 324-325, 405, 754, 847, 952, 987, 990 y 999 mostraron una inhibición superior al 50%.

Aún más particularmente, los compuestos 324, 952, 987, 990 y 999 mostraron una inhibición superior al 90%.

2.- Medición del efecto del compuesto sobre la fosforilación de tau mediada por Ck1d

La fosforilación in vivo de la proteína Tau es compleja y tiene una variedad de proteínas cinasas putativas implicadas. Se acepta en general que las cinasas GSK3b y CDK5 son piezas clave en la generación de FHA Tau, la forma patógena que se encuentra en los ovillos neurofibrilares en la enfermedad de Alzheimer. Más recientemente, ha habido una evidencia creciente que apoya la función de otras cinasas, particularmente de CK1δ en la hiperfosforilación de Tau in vivo. Hanger et al. 2007 (J. Biol. Chem. 282, 23645-23654) identificaron 37 sitios de fosforilación en FHA Tau humana y fueron capaces de recapitular estos sitios in vitro usando tau recombinante y diversas preparaciones de cinasas purificadas. Estos estudios identificaron que ciertos sitios estaban fosforilados de forma única por CK1δ y que algunos otros sitios requerían CK1δ y otra cinasa, proporcionando CK1δ una fosforilación aguas arriba para hacer que el sitio diana estuviera disponible para la segunda cinasa. Por lo tanto, para evaluar si los compuestos candidatos inhibían de forma selectiva la actividad de CK1δ ya fuera directamente o a través del bloqueo de su cebado para otras cinasas, se ha desarrollado una variedad de escrutinios diferentes. El concepto general de estos escrutinios se proporciona en el documento WO2005/001114.

Para medir el efecto de los inhibidores putativos de CK1δ sobre los niveles de la fosforilación mediada por CK1δ, se realizaron ensayos de seguimiento de la reacción seleccionada que proporcionaron una medición cuantitativa relativa de la ocupación de los grupos fosfato en sitios específicos en formas murinas endógenas y humanas transgénicas de Tau.

El ensayo PhosphoTau SRM V2 mide los niveles de fosforilación de tau totales y relativos en cinco de los sitios más estudiados en Tau y se obtuvo de Proteome Sciences plc (Cobham, Inglaterra). Ninguno de los sitios en el ensayo V2 está fosforilado únicamente por CK1δ y existe una posibilidad de que la inhibición inducida por el compuesto de la fosforilación medida por este método, se puede lograr a través de una inhibición promiscua de otras cinasas, tales como GSK3b y/o CDK5. Para hacer frente a esta limitación, Proteome Sciences ha desarrollado un ensayo V3 que mide la tau total y dos sitios que se fosforilan exclusivamente con CK1δ, además de otros cuatro que se han observado que se fosforilan in vitro con al menos otra cinasa Tau además de CK1δ. La Tabla 1 enumera los diferentes sitios ocupados y las cinasas Tau candidatas descritas en Hanger et al. (2007).

Tabla 1: Sitios de fosforilación de Tau ocupados mediante ensayos de fosforilación de Tau SRM V2 y V3

Número de sitio

Cinasas candidatas

Ensayo V2

Ser181 GSK3b Ser199 CK2, GSK3b, PKA Thr231 GSK3b, PKA Ser262 CK1δ, GSK3b, PKA Ser396 CK1δ, CK2, GSK3b

Ensayo V3

Ser46 CK1δ, GSK3b Thr50 CK1δ, GSK3b Ser113* CK1δ Ser396 CK1δ, CK2, GSK3b Ser404 CK1δ, CK2, GSK3b Ser433* CK1δ Numeración basada en tau 2N4R humana.

* - sitio único CK1d

Línea celular SH-SY5Y-TMHT

La línea celular SH-SY5Y-TMHT (JSW Life Sciences, Graz, Austria) representa un modelo in vitro de tauopatía. La línea celular se crea transfectando de forma estable la línea celular SH-SY5Y obtenida a partir de neuroblastoma humano, con un vector que contiene toda la isoforma de Tau 2N4R humana de longitud completa que es portadora de dos mutaciones comunes asociadas con la enfermedad (V337M/R406W). En estudios recientes (Flunkert et al.

presentado en 2011, Loeffler et al. presentado en 2011) tanto la línea celular SH-SY5Y-TMHT como la línea de ratón transgénico que es portadora del mismo transgén humano, mostraron un alto nivel de expresión de Tau humana que se había hiperfosforilado en múltiples epítopos, lo que se había demostrado previamente en varias tauopatías humanas incluyendo la enfermedad de Alzheimer. Además, en las células SH-SY5Y-TMHT expuestas a diferentes inhibidores de cinasas, incluyendo el inhibidor de JNK SP600125 y el inhibidor de CK1 IC261, los niveles de fosforilación de Tau en los sitios patogénicos clave se redujeron en patrones consistentes con la especificidad del sitio conocida de la cinasa específica. Por tanto, la línea celular SH-SY5Y-TMHT es muy adecuada para el escrutinio de nuevos inhibidores de la cinasa Tau.

Escrutinio del compuesto en células SH-SY5Y-TMHT

Las células SH-SY5Y-TMHT se cultivan en medio de cultivo (medio DMEM, 10% de FCS, 1% de NEAA, 1% de L- glutamina, 100 µg/ml de gentamicina, 300 µg/ml de geneticina G-418) durante 2 días hasta tener 80-90% de confluencia. A continuación, las células se diferencian en medio de cultivo complementado con ácido retinoico (AR) 10 μΜ durante 7 días, cambiando el medio cada 2 a 3 días. Las células diferenciadas se siembran en placas de 6 pocillos y placas de 96 pocillos con una densidad celular de 1,25 x 106 y 8 x 105 células por pocillo, respectivamente. El día 8 después de la diferenciación, se añadieron los compuestos del ensayo, los compuestos de referencia y el vehículo de control al medio de cultivo. Después de 6 h de exposición del compuesto, una placa de células se sometió a un ensayo MTT para evaluar el efecto de los elementos del ensayo y de referencia sobre la viabilidad celular. Los pocillos restantes se lavan una vez con PBS sin radiactividad y se recogen en 300 μΙ de tampón RIPA [Tris 50 mM pH 7,4, 1% de Nonident P40, 0,25% de Na-desoxi-colato, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NaF 1 μΜ, Na- orto-vanadato 1 μΜ, glicerofosfato 80 mM, complementado con proteasa recién añadida (Calbiochem) y mezcla de inhibidor de fosfatasa (Sigma)]. La suspensión celular se transfiere a un tubo de 1,5 ml y, además, se lisa mediante ultrasonidos sobre hielo. Se toma una parte alícuota de 20 μΙ para determinar la concentración de proteína (ensayo BCA). Posteriormente, los lisados se congelan rápidamente y se almacenan a -80°C hasta su envío.

Dos experimentos independientes en tres (cuatro) replicados técnicos, se llevan a cabo como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2

Experimento Células Tratamiento Concentración Evaluación Vehículo - Compuesto 324 10-5-1-0,5-0,1-0,05 µM ExpA SH-SY5Y-TMHT MTT BSA TauP V2 TauP V3 Compuesto 987 10-5-1-0,5-0,1-0,05 µM PF670462 1-0,5-0,1 µM Vehículo - Compuesto 324 10-5-1-0,5-0,1-0,05 µM ExpB SH-SY5Y-TMHT MTT BSA TauP V2 TauP V3 Compuesto 987 10-5-1-0,5-0,1-0,05 µM PF670462 1-0,5-0,1 µM

Pruebas de viabilidad de la célula

Para determinar la actividad del compuesto, es necesario controlar la toxicidad celular potencial de todas las moléculas. La viabilidad de los cultivos se determina mediante el ensayo MTT. Este ensayo permite la medición de la actividad deshidrogenasa mitocondrial que reduce el MTT amarillo a cristales de formazán de color azul oscuro. Dado que esta reacción está catalizada en las células vivas, este ensayo se utiliza solamente para la determinación de la viabilidad celular. La solución de MTT se añade a cada pocillo con una concentración final de 0,5 mg/ml.

Después de 2 horas, el medio que contiene MTT se aspira. Las células se lisan en 3% de SDS y los cristales de formazán se disuelven en isopropanol/HCl. La densidad óptica se mide con un lector de placas a una longitud de onda de 570 nm. La tasa de supervivencia celular se expresa como densidad óptica (DO). Los valores se calculan como el porcentaje de los valores de control.

Determinación cuantitativa del contenido total en proteína

Antes de la evaluación del estado de fosforilación específica de Tau, la concentración de proteína total en cada lisado celular se determina usando un ensayo BCA estándar (Pierce Biotechnology, Rockford, EE.UU.) Brevemente, se utilizaron 20 μΙ de lisado celular en el ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Determinación cuantitativa de Tau total y Tau fosforilada

Ensayos de espectrometría de masas

Los lisados celulares totales de las líneas celulares TMHT tratadas con el Compuesto 324, el Compuesto 987, PF670462 y un vehículo de control correspondiente, respectivamente, se someten primero a SDS-PAGE en una dimensión para purificar la fracción proteica. Los geles de apilamiento se cargan con aproximadamente 100 µg de proteína total, basándose en los resultados del ensayo BCA. Los geles se ejecutan hasta que el contenido de proteína total forma una sola banda discreta en el gel de apilamiento. A continuación, cada banda de proteína se corta del gel y se digiere con tripsina o Asp-N y se analiza usando el ensayo V2 o V3 de PhosphoTau SRM, respectivamente. Cada método de ensayo cuantifica la fosforilación en el material preclínico, utilizando un espectrómetro de masas triple cuadrupolo (TSQ Vantage, Thermo Scientific, Hemel Hempstead, GB). Antes del análisis SRM, los fosfopéptidos y las muestras preclínicas se resolvieron mediante cromatografía RP (columna XBridge, Waters, Manchester, GB) sobre un gradiente de 9 minutos de 0-30% de ACN (tampón A; 0,1% de FA, tampón B; ACN, 0,1% de FA). Versiones ligeras y pesadas de cada péptido y fosfopéptido se supervisaron mediante varias transiciones SRM, utilizando valores S de lentes optimizadas y una configuración de energía de colisión. El área bajo el pico de SRM LC se utilizó para cuantificar la cantidad de analito presente en cada lisado celular como un único punto de referencia para la señal del péptido pesado añadido. Una curva de calibración de 11 puntos de fosfopéptidos ligeros, en donde a cada punto de la curva se añadió 100 fmol de fosfopéptidos pesados, también se produjo para determinar las características del ensayo (LOD, LOQ, precisión y exactitud). Para cada población tau especificada, el nivel endógeno de cada fosfopéptido tau se cuantificó frente a su curva de calibración (0,25-1000 fmol en la columna). Antes del análisis LC-SRM, a cada población de tau se añadió 100 fmol de los patrones de fosfopéptidos pesados. Todos los datos se procesaron utilizando el programa informático Pinpoint (Thermo Scientific) y los resultados se presentaron como pg de fosfopéptido/µg de proteína total.

Transferencia Western

Los lisados de las células tratadas se prepararon en tampón Laemmli y 10 µg se cargaron en cada pista de un gel Nu-PAGE al 10% (Invitrogen, GB). Las muestras se ejecutaron hasta que la parte delantera del colorante azul de Coomassie estaba a 1 cm de la parte inferior del gel. Las proteínas separadas se transfirieron a nitrocelulosa y se desarrollaron las transferencias utilizando anticuerpos específicos para tau total (Tau policlonal de conejo anti- humana, Dako, GB (nº de cat. A0024)) y anticuerpo de fosfo-treonina 231 (Tau fosfo-Thr231), Signalway Antibody, EE.UU. (nº de cat. 11110)), respectivamente. En cada caso el anticuerpo unido se detectó empleando IgG de conejo de ECL, ligada a HRP (de burro) (GE Healthcare, GB (nº de cat. NA934)) Resultados

Efecto de los compuestos del ensayo y de referencia sobre la viabilidad celular de las células SH-SY5Y- TMHT

La viabilidad celular se determinó en células SH-SY5Y-TMHT diferenciadas mediante el ensayo MTT. Los compuestos del ensayo y de referencia se aplicaron en un intervalo de concentración de 0,05 μΜ a 10 μΜ y de 0,1 μΜ a 1 μΜ, respectivamente. Después de 6 h de tratamiento, se evaluó la viabilidad celular. La Figura 1 muestra el efecto del Compuesto 324 sobre la viabilidad celular de las células SH-SY5Y-TMHT en donde el gráfico representa el efecto del Compuesto 324 sobre la viabilidad celular de las células SH-SY5Y-TMHT en % de vehículo control (VC, barra blanca). La significación estadística se indica con *<0,05, **<0,01, ***<0,001, según lo determinado por ANOVA de un factor. Se muestran los datos de dos experimentos independientes como media del grupo +/- SEM (n = 8). Se puede observar en la Figura 1 que el Compuesto 324 mostraba un efecto protector sobre la viabilidad celular de las células SH-SY5Y-TMHT de una manera dependiente de la dosis, aunque el efecto era solo estadísticamente significativo a una concentración de 10 μΜ. La Figura 2 muestra el efecto del Compuesto 987 sobre la viabilidad celular de las células SH-SY5Y-TMHT, en donde el gráfico representa el efecto del Compuesto 987 sobre la viabilidad celular de las células SH-SY5Y-TMHT en % de vehículo control (VC, barra blanca). La significación estadística se indica con *<0,05, **<0,01, ***<0,001 según lo determinado por ANOVA de un factor. Se muestran los datos de dos experimentos independientes como media del grupo +/- SEM (n = 8). Se puede observar en la Figura 2 que el Compuesto 987 disminuyó la viabilidad celular en el intervalo de concentración más baja y más alta. A una concentración de 1 y 0,5 μΜ no se observó ningún efecto citotóxico. La Figura 3 muestra el efecto de PF670462 sobre la viabilidad celular de las células SH-SY5Y-TMHT, en donde el gráfico representa el efecto de PF670462 sobre la viabilidad celular de las células SH-SY5Y-TMHT en % de vehículo control (VC, barra blanca). La significación estadística se indica con *<0,05, **<0,01, ***<0,001, según lo determinado por ANOVA de un factor. Se muestran los datos de dos experimentos independientes como media del grupo +/- SEM (n = 8). Se puede observar en la Figura 3 que el compuesto de referencia PF 670462 solo muestra un efecto protector significativo sobre la viabilidad celular de las células SH-SY5Y-TMHT a una concentración de 0,5 μΜ.

Determinación de proteínas de las células SH-SY5Y-TMHT después del tratamiento

La concentración de proteína de los lisados celulares de las células SH-SY5Y-TMHT tratadas, se determinó usando un ensayo de BCA convencional. La cantidad de proteína se determinó de todas las muestras por duplicado. La concentración de proteína de las muestras estaba en el intervalo esperado, de acuerdo con la cantidad de células sembradas por placa de 12 pocillos, que oscilaba entre 150-350 µg/ml.

Determinación del efecto del tratamiento del compuesto sobre los sitios de fosforilación específicos

Ensayo de espectrometría de masas

El ensayo de los lisados de células SH-SY5Y-TMHT se realizó usando el ensayo de V2 y V3 de PhosphoTau SRM. Cuando el nivel relativo de fosforilación en cada sitio se comparaba con la proporción en los controles tratados con vehículo, había una clara reducción del nivel de fosfopéptidos en las células tratadas con el Compuesto 324 (datos mostrados para 10 μΜ) y el Compuesto 987 (datos mostrados para 10 μΜ). Un ejemplo que muestra una reducción de la fosforilación en la serina 396 se muestra en la Figura 4. Esta Figura muestra la determinación de la espectrometría de masas de compuestos selectivos para CK1d sobre la fosforilación de la serina 396 en las células SH-SY5Y-TMHT. El panel A muestra las células tratadas con vehículo de control (VC) o el Compuesto 324 (Τ.Ι.1_10μΜ) y el Panel B muestra las células tratadas con vehículo de control (VC) o el Compuesto 987 (T.I.2_10μΜ).

En las células expuestas al vehículo de control, aproximadamente el 83% de Tau se fosforila en S396. El tratamiento con el Compuesto 324 10 μΜ reduce este valor al 38%, mientras que el Compuesto 987 10 μΜ reduce los niveles de pS396 al 24%. Estos resultados confirman la inhibición de pS396 a través de reactivos selectivos de CK1d.

Ensayo de transferencia Western

Los niveles de Tau total y Tau fosforilada en la treonina 231 en lisados de células SH-SY5Y-TMHT tratados con el vehículo de control, el Compuesto 394 (10 μΜ), el Compuesto 987 (10 μΜ) y PF670462 (5 μΜ), se cuantificaron mediante una transferencia Western. La Figura 5 muestra la medición de la transferencia Western de pT231 (panel A) y los niveles de Tau total (panel B) en las células SH-SY5Y-TMHT tratadas con inhibidores selectivos de CK1d. Como se muestra en la Figura 5, los tres compuestos reducían el nivel detectable de pT231 en la proteína Tau, mientras que este epítopo estaba muy presente en las células tratadas con vehículo. No había una diferencia significativa en los niveles detectables de Tau total entre las preparaciones que eran distintas del lisado tratado con PF670462, el cual parecía contener marginalmente menos Tau total que las otras. Estos resultados confirman la inhibición de pT231 a través de reactivos selectivos de CK1d.

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (IB) o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo: en donde "Het B" representa indolilo o indolizinilo; Z representa CO; R1b representa arilo, cicloalquilo C3-8, heterociclilo monocíclico o bicíclico o un sistema de anillos de heteroarilo monocíclico o bicíclico, en donde R1b puede estar sustituido por uno o varios (p. ej., 1, 2 o 3) grupos R4b; R4b representa grupos halógeno, alquilo C1-6, alquenilo C1-6, alquinilo C1-6, cicloalquilo C3-8, haloalquilo C1-6, hidroxilo, alcoxi C1-6, -O-alquenilo C1-6, haloalcoxi C1-6, -COOH, -CO-alquilo C1-6, -COO-alquilo C1-6, -CONH2, -CH2-CONH2, -NH-alquilo C1-6, -NH-alquenilo C2-6, -NH-CO-alquilo C1-6, -CO-NH-alquilo C1-6, -O-CH2-CO-NH-alquilo C1-6, -CH2- CH2-CO-NH-alquilo C1-6, -S-alquilo C1-6, -SO-alquilo C1-6, -SO2-alquilo C1-6, -SO2-NH2, -SO2-NH-alquilo C1-6, -S-CH2- CO-alquenilo C2-6, -SO2-OH, amino, ciano, NO2, =O, -CO-NH-(CH2)2)-OMe, -NH-cicloalquilo C3-8, -CH2-CO-NH- cicloalquilo C3-8, -CO-heterociclilo, -CO-heteroarilo, -COO-(CH2)2-heterociclilo, -CH2-arilo, -OCH2-arilo, -OCH2- heteroarilo, -CH2-O-CO-arilo, -O-arilo, -NH-CO-arilo, -NH-CO-heteroarilo, -NH-CO-CH2-arilo, -NH-arilo, arilo o heteroarilo, en donde dichos grupos arilo, heterociclilo o heteroarilo de R4b pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos halógeno, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, =S o hidroxilo y en donde dichos grupos alquilo C1-6 o alquenilo C2-6 de R4b pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos hidroxilo, amino, ciano, alcoxi C1-6, CONH2 o -COO-alquilo C1-6; m representa 2; y R2b representa amino o -CONH2.

2. Una composición farmacéutica según se define en la reivindicación 1, en donde R1b representa un sistema de anillos de arilo o heteroarilo monocíclico, en donde R1b se puede sustituir por uno o varios (p. ej., 1, 2 o 3) grupos R4b.

3. Una composición farmacéutica según se define en la reivindicación 2, en la que R1b representa un grupo arilo monocíclico tal como fenilo sustituido opcionalmente con uno o varios (p. ej., 1) grupos R4b o un grupo heteroarilo monocíclico tal como tienilo, pirimidinilo o pirazolinilo sustituido opcionalmente con uno o varios (p. ej., 1 o 2) grupos R4b.

4. Una composición farmacéutica según se define en la reivindicación 3, en la que R1b representa fenilo sustituido opcionalmente con uno o varios (p. ej., 1) grupos R4b.

5. Una composición farmacéutica según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 to 4, en donde R4b representa grupos halógeno, hidroxilo, -O-alquenilo C1-6, -COO-alquilo C1-6, -NH-alquilo C1-6, -SO2-NH2, amino, ciano, =O, -CH2-CO-NH-cicloalquilo C3-8, -CH2-arilo, -OCH2-heteroarilo, -O-arilo, -NH-CO-arilo, -NH-arilo o heteroarilo, en donde dichos grupos arilo, heterociclilo o heteroarilo de R4b pueden estar sustituidos opcionalmente con uno o varios grupos halógeno, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, =S o hidroxilo y en donde dichos grupos alquilo C1-6 o alquenilo C2-6 de R4b pueden estar sustituidos opcionalmente con uno o varios grupos hidroxilo, amino, ciano, alcoxi C1-6, CONH2 o -COO-alquilo C1-6.

6. Una composición farmacéutica según se define en la reivindicación 5, en la que R4b representa halógeno (p. ej., flúor), amino o heteroarilo (p. ej., piridilo).

7. Una composición farmacéutica según se define en la reivindicación 6, en la que R4b representa halógeno (p. ej., flúor).

8. Una composición farmacéutica según se define en la reivindicación 1, en la que el compuesto de fórmula (IB) se selecciona a partir de cualquiera entre: 2-amino-3-[(tiofen-2-il)carbonil]indolizin-1-carboxamida (Compuesto 847); 2-amino-3-[(4-fluorofenil)carbonil]indolizin-1-carboxamida (Compuesto 987); 2-amino-3-benzoilindolizin-1-carboxamida (Compuesto 990); 2-amino-1-[(4-fluorofenil)carbonil]-1H-indol-3-carboxamida (Compuesto 999); o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos.

9. Una composición farmacéutica según se define en la reivindicación 8, en la que el compuesto de fórmula (IB) se selecciona a partir de uno cualquiera entre: 2-amino-3-[(4-fluorofenil)carbonil]indolizin-1-carboxamida (Compuesto 987); y 2-amino-1-[(4-fluorofenil)carbonil]-1H-indol-3-carboxamida (Compuesto 999); o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos.

10. Una composición farmacéutica según se define en la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde el compuesto de fórmula (IB) es 2-amino-3-[(4-fluorofenil)carbonil]indolizin-1-carboxamida (Compuesto 987) o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable de la misma.

11. Un compuesto de fórmula (IB) según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para uso en terapia.

12. Un compuesto de fórmula (IB) según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para uso como inhibidor de la caseína cinasa delta (CK1δ) en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo, tal como las tauopatías.

13. El compuesto para uso según se define en la reivindicación 12, en el que la tauopatía se selecciona entre la enfermedad de Alzheimer, la demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17 (FTDP-17), la parálisis supranuclear progresiva (PSP), la enfermedad de Pick, la degeneración corticobasal, la atrofia multisistémica (MSA), la degeneración neurobasal con acumulación de hierro, tipo 1 (Hallervorden-Spatz), la demencia con granos argirófilos, el síndrome de Down, los ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, la demencia pugilística, la enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, la distrofia miotónica, la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, la gliosis subcortical progresiva, la angiopatía amiloide cerebral con proteína priónica, la demencia solo con ovillos, el parkinsonismo postencefalítico, la panencefalitis esclerosante subaguda, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, el complejo esclerosis lateral amiotrófica/demencia con parkinsonismo, la enfermedad de la motoneurona no de Guam con ovillos neurofibrilares/demencia y la enfermedad de Parkinson.

14. El compuesto para uso según se define en la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que la tauopatía comprende la enfermedad de Alzheimer.

15. El compuesto para uso según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde el compuesto es 2-amino-3-[(4-fluorofenil)carbonil]indolizin-1-carboxamida (Compuesto 987).